视网膜色素变性（RP）是一种严重影响视力的疾病，主要累及视杆细胞从而导致夜盲，疾病终末期由于视锥细胞同时受累造成患者中心视力和周边视力丧失，目前尚无有效治疗手段。但有研究发现，在RP病理过程中虽然丧失了光感受器的功能，双极细胞和神经节细胞的功能以及与视觉中枢的神经连接却得以保存，为光遗传学在其治疗上的应用提供了条件。光遗传学通过在神经元上表达以视紫红质离子通道蛋白-2为代表的光敏蛋白，控制神经元兴奋性，在重塑视网膜感光功能方面表现出了极大的应用前景，也为RP这一类视网膜变性疾病的治疗提供了一种有效的治疗选择。
引用本文： 张轶, 黄熙, 张军军. 光遗传学在视网膜色素变性治疗中的研究进展. 中华眼底病杂志, 2018, 34(6): 601-604. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.018 复制
视网膜色素变性（RP）是一类严重影响视力的视网膜变性疾病，可引起光感受器不可逆性进行性死亡。目前针对RP尚无有效治疗手段。光遗传学是一项结合光学和遗传学相关知识，利用基因编码光敏蛋白并通过光控制细胞兴奋性的技术，目前主要用于神经元研究。视紫红质离子通道蛋白-2（ChR2）是其中极为重要的一种光敏蛋白。视网膜作为中枢神经系统的一部分，具有三级神经元结构，在RP的病理过程中虽然丧失了光感受器功能，但是双极细胞和视网膜神经节细胞（RGC）的功能以及与视觉中枢的神经连接却得以保存。基于此，近年来研究者们陆续发现ChR2等光敏蛋白在RP治疗中的应用前景。现就视网膜神经元的功能、RP以及光遗传学在RP治疗中的应用情况作一简要综述。
1 视网膜神经元的构成和功能
哺乳动物的视网膜作为中枢神经系统的一部分，由5类不少于60种不同神经元和一类神经胶质细胞组成。光感受器接收光刺激，激活视紫红质后启动G蛋白偶联受体，进一步激活下游酶链反应，将输入光信号转换为输出电信号并传导至RGC，由RGC将来自双极细胞和无长突细胞的信号整合编译成大约20种不同的信号传递至视皮层[1]。其中，双极细胞分为视锥双极细胞和视杆双极细胞，视锥双极细胞分为ON和OFF两种类型。水平细胞和无长突细胞主要起抑制性调节作用[2]。
视觉信号的传递主要依靠神经递质，视网膜对视觉信号的处理起源于光感受器，其突触末端释放兴奋性神经递质谷氨酸。在视锥细胞信号传导通路中，视锥细胞与两种水平细胞和8种视锥双极细胞形成突触连接，这些视锥细胞的突触后细胞表达不同类型的谷氨酸受体[2-4]。水平细胞和OFF视锥双极细胞表达亲离子型谷氨酸受体（AMPA＜á-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid＞和kainate），与谷氨酸结合后阳离子通道开放；ON视锥双极细胞表达亲代谢型谷氨酸受体（mGluR6），与谷氨酸结合后阳离子通道TRPM1关闭[5]。由于光刺激时视锥细胞超极化造成谷氨酸释放减少，水平细胞和OFF视锥双极细胞的阳离子通道开放减少，导致细胞超极化即细胞功能抑制；而ON视锥双极细胞的阳离子通道开放增加导致去极化，即细胞兴奋[6-7]。最后的结果是，OFF-RGC接受来自OFF视锥双极细胞的信号减少，即光刺激下OFF-RGC功能被抑制；而ON-RGC接受来自ON视锥双极细胞的信号增加，即光刺激下ON-RGC细胞兴奋。从功能学角度看，暗刺激引起OFF-RGC兴奋，而光刺激引起ON-RGC兴奋。
类似于视锥细胞，视杆细胞也释放神经递质谷氨酸，在光刺激下出现超极化，谷氨酸释放减少。视杆细胞的突触后细胞为水平细胞和视杆双极细胞，水平细胞表达亲离子型谷氨酸受体，而视杆双极细胞表达mGluR6并在光刺激情况下去极化[8-9]。然而视杆双极细胞并非直接将信号传导至RGC，而是通过谷氨酸能神经突触传导至AⅡ无长突细胞[10-11]。AⅡ无长突细胞通过缝隙连接与ON视锥双极细胞的轴突发生连接，并与OFF视锥双极细胞形成抑制性（甘氨酸能）突触连接，通过这些视锥双极细胞将信号传导至相应RGC[2]。
2 RP
视网膜变性疾病的一个共同特征是光感受器的进行性死亡，其中RP是一种最常见的视网膜遗传病，通常双眼发病，其基因突变导致的损伤主要累及视杆细胞，从而造成夜盲。随着疾病进展，变性的细胞由视网膜周边部向视网膜后极部发展，从而残留管状视野，疾病终末期由于视锥细胞同时受累造成患者中心视力和周边视力均丧失[12]。目前已经发现超过50种基因的100个位点与RP相关，其中约20%为常染色体隐性遗传，10%～20%为常染色体显性遗传，还有10%为X连锁隐性遗传，其余为无家族史的散发病例[13]。目前RP尚无法治愈，但是一些治疗方法已经进入试验阶段。第一类方法为基因替代治疗，针对Leber先天性黑矇进行的基因研究进展[14] 为RP基因治疗提供了一个很好的借鉴；第二类方法致力于减缓光感受器变性从而减缓病情的发展；第三类方法旨在通过建立新的光感受器细胞重塑视网膜功能。在这三类方法中，基因治疗是最理想的方法。但RP是一种多基因致病的疾病，目前已经检测到超过50种基因的3000种突变可以致病[15]。同时，疾病后期视锥细胞同样受累，而基因治疗尚无法解决如此庞大的基因问题以及视锥细胞受累的问题。一种更具有可实施性的治疗手段是利用光遗传学，即通过在变性的视网膜上表达光敏蛋白重建视网膜的感光功能。这种光敏蛋白必须能够独立且直接地将光信号转化为电信号，而不依赖于其他信号通路。ChR2就是这样一种光敏蛋白。
3 光遗传学和ChR2
广义上来讲，光遗传学是指一种将表达光敏蛋白的基因编码至靶神经元，通过光刺激控制这些靶细胞激活的方法[16]。光敏蛋白在靶细胞的主要表达方式包括以病毒为载体进行转染和转基因小鼠。该技术涉及的光敏蛋白主要包括两类：微生物视蛋白和动物视蛋白。有脊椎动物和无脊椎动物的光反应过程具有明显区别，虽然都使用视紫红质这种由视黄醛与7次跨膜的螺旋形视蛋白共价结合的蛋白，但对于有脊椎动物，光刺激激活视紫红质后启动G蛋白偶联受体激活下游酶链反应，导致环磷酸鸟苷（cGMP）水解和cGMP门控阳离子通道关闭，最终细胞超级化[17]。无脊椎动物虽然也使用G蛋白偶联受体，但在光刺激下直接导致瞬时受体电势通道的激活和细胞快速的去极化[18]。ChR是一种微生物视蛋白，同样属于光敏离子通道蛋白，最初从绿藻中分离而来，介导其趋光性[19-20]。ChR2是其中一种ChR的亚型，同样具有7次跨膜的螺旋形蛋白结构，主要吸收蓝光（最大吸收波长～470 nm），受到蓝光刺激时引起阳离子通道开放，出现峰值电流，迅速引起细胞去极化，随后进入静息状态，紧接着给予第二次光刺激时出现的电流峰值明显减小，但是在黑暗条件中等待数秒之后，峰值将恢复正常[21-24]。这种在适宜波长光刺激下引起细胞快速去极化的性质，使其成为研究神经元功能的重要工具。2005年开始，研究者们陆续将ChR2表达到神经元上，通过蓝光刺激引起细胞去极化，精确控制神经元的活化，从而研究其基本功能以及病理情况下的功能改变[25-29]。
4 ChR2与RP
此前研究者还只是将ChR2应用在神经元功能方面的研究，随后一些视网膜的研究者开始关注到这种光敏蛋白在重塑视网膜感光方面的潜力。2006年，Bi等[30]首先通过将ChR2表达在rd1小鼠的视网膜上成功重建了部分视功能。rd1小鼠是一种常用的RP动物模型，研究者将以腺相关病毒-2为载体的ChR2注入rd1小鼠的玻璃体腔，ChR2非特异性的表达在RGC，这些细胞在RP患者的光感受器死亡后还能存活多年[31]。该研究发现，这种方法可以使失去光感的视网膜重新感光，并能将这些光信号传导至视皮层。然而视网膜并非单纯传导光信号，过去的观点认为复杂的视觉信号由视觉中枢处理，而近年来的研究提示之前我们一直低估了视网膜对视觉信号的处理能力，一些复杂的视觉信号的整合编译在视网膜就完成了，例如物体运动、颜色、对比等视觉信号[32-33]。所以虽然在RGC上表达ChR2可以使视网膜感光，但是却遗失了视网膜对许多视觉信号的编译能力。于是，有研究者将ON双极细胞作为靶细胞，通过光遗传学的方法不仅使视网膜重获光感，而且重塑了部分视觉相关的行为[34-35]。当然，如果能恢复视网膜第一级神经元的光感，无疑将最大程度上重塑视觉功能，而且视锥细胞在失去感光功能后还能存活很长时间。基于此，已经有研究者通过光遗传学的方法使RP动物模型在光感受器的层面即重获光感，而且记录到了视网膜的一些重要的生理功能，如方向选择、明暗对比等[36-37]。但是考虑到在疾病的晚期，残存的光感受器数量极少[38] ；所以，重塑光感受器感光功能的临床意义还需要更深入的研究。
由于ChR2的发现时间早，对ChR2的认识和研究比较深入，所以目前大部分应用光遗传学重塑视网膜视觉功能的研究都围绕ChR2展开；但是除此之外，还有很多光敏蛋白也被应用于视觉重塑的研究。对黄光敏感的噬盐菌视紫红质同样是一种微生物视蛋白，被激活时引起氯离子通道开放，导致细胞功能抑制。研究者将该蛋白和ChR2分别表达至视网膜的OFF细胞和ON细胞，以更大程度上模拟自然条件下的光反应过程[39]。虽然相对于微生物视蛋白而言，动物视蛋白的结构和信号传导通路更复杂，但是研究者们仍不断尝试将其应用于视功能的重塑，例如黑视蛋白在视网膜神经元上的表达，可使rd1小鼠重塑部分视觉相关行为[40-41]。此外，研究者们还尝试将这些视蛋白表达于不同的视网膜神经元，甚至是分别表达在神经元的胞体和树突，以最大程度地重塑视网膜的视觉功能[42]。
5 问题和展望
虽然目前关于光遗传学在视功能重塑中的研究取得了令人瞩目的成果，也为RP这一类视网膜变性疾病提供了一种极具价值和前景的治疗方案，但是在运用过程中，我们需要密切监测可能出现的问题。首先，病毒作为基因载体注入玻璃体腔可能引起免疫反应和视网膜毒性[43]。此前一些关于视网膜疾病基因治疗的临床前研究和前期临床研究并未观察到视网膜转染导致的并发症[44]。两项在啮齿类动物视网膜上表达ChR2的长期研究也未观察到严重的并发症[45-46]。当然，在其他灵长类动物和人类视网膜上的试验数据也是必不可少的。此外，通过光遗传学重塑的视网膜感光系统依然无法完全模拟生理情况的视网膜功能。一方面，由于ChR2等光敏蛋白具有固定的感光域，只能被一定波长的光线激活；另一方面，虽然既往研究记录到利用光遗传学的方法可以使视网膜获得光感，并使实验动物一些视觉相关的行为重建，但是试验需要较高的光强度，而这在实际生活中很难达到。随着研究的不断深入，具有更高光敏度和更广感光域的ChR亚型被发现，为以后的研究提供了更多的可能[47-48]。
目前关于光遗传学的研究均还围绕着动物实验进行，如果要评估其在疾病治疗中的应用前景，在灵长类动物和人视网膜上的研究必不可少，而体外培养的视网膜为我们进一步的研究提供了可能[49]。总之，光遗传学的出现具有划时代的意义，大量研究也提示了其在RP治疗中的前景，但是在应用到临床之前仍需要对安全性和有效性进行大量长期的研究和观察。
视网膜色素变性（RP）是一类严重影响视力的视网膜变性疾病，可引起光感受器不可逆性进行性死亡。目前针对RP尚无有效治疗手段。光遗传学是一项结合光学和遗传学相关知识，利用基因编码光敏蛋白并通过光控制细胞兴奋性的技术，目前主要用于神经元研究。视紫红质离子通道蛋白-2（ChR2）是其中极为重要的一种光敏蛋白。视网膜作为中枢神经系统的一部分，具有三级神经元结构，在RP的病理过程中虽然丧失了光感受器功能，但是双极细胞和视网膜神经节细胞（RGC）的功能以及与视觉中枢的神经连接却得以保存。基于此，近年来研究者们陆续发现ChR2等光敏蛋白在RP治疗中的应用前景。现就视网膜神经元的功能、RP以及光遗传学在RP治疗中的应用情况作一简要综述。
1 视网膜神经元的构成和功能
哺乳动物的视网膜作为中枢神经系统的一部分，由5类不少于60种不同神经元和一类神经胶质细胞组成。光感受器接收光刺激，激活视紫红质后启动G蛋白偶联受体，进一步激活下游酶链反应，将输入光信号转换为输出电信号并传导至RGC，由RGC将来自双极细胞和无长突细胞的信号整合编译成大约20种不同的信号传递至视皮层[1]。其中，双极细胞分为视锥双极细胞和视杆双极细胞，视锥双极细胞分为ON和OFF两种类型。水平细胞和无长突细胞主要起抑制性调节作用[2]。
视觉信号的传递主要依靠神经递质，视网膜对视觉信号的处理起源于光感受器，其突触末端释放兴奋性神经递质谷氨酸。在视锥细胞信号传导通路中，视锥细胞与两种水平细胞和8种视锥双极细胞形成突触连接，这些视锥细胞的突触后细胞表达不同类型的谷氨酸受体[2-4]。水平细胞和OFF视锥双极细胞表达亲离子型谷氨酸受体（AMPA＜á-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid＞和kainate），与谷氨酸结合后阳离子通道开放；ON视锥双极细胞表达亲代谢型谷氨酸受体（mGluR6），与谷氨酸结合后阳离子通道TRPM1关闭[5]。由于光刺激时视锥细胞超极化造成谷氨酸释放减少，水平细胞和OFF视锥双极细胞的阳离子通道开放减少，导致细胞超极化即细胞功能抑制；而ON视锥双极细胞的阳离子通道开放增加导致去极化，即细胞兴奋[6-7]。最后的结果是，OFF-RGC接受来自OFF视锥双极细胞的信号减少，即光刺激下OFF-RGC功能被抑制；而ON-RGC接受来自ON视锥双极细胞的信号增加，即光刺激下ON-RGC细胞兴奋。从功能学角度看，暗刺激引起OFF-RGC兴奋，而光刺激引起ON-RGC兴奋。
类似于视锥细胞，视杆细胞也释放神经递质谷氨酸，在光刺激下出现超极化，谷氨酸释放减少。视杆细胞的突触后细胞为水平细胞和视杆双极细胞，水平细胞表达亲离子型谷氨酸受体，而视杆双极细胞表达mGluR6并在光刺激情况下去极化[8-9]。然而视杆双极细胞并非直接将信号传导至RGC，而是通过谷氨酸能神经突触传导至AⅡ无长突细胞[10-11]。AⅡ无长突细胞通过缝隙连接与ON视锥双极细胞的轴突发生连接，并与OFF视锥双极细胞形成抑制性（甘氨酸能）突触连接，通过这些视锥双极细胞将信号传导至相应RGC[2]。
2 RP
视网膜变性疾病的一个共同特征是光感受器的进行性死亡，其中RP是一种最常见的视网膜遗传病，通常双眼发病，其基因突变导致的损伤主要累及视杆细胞，从而造成夜盲。随着疾病进展，变性的细胞由视网膜周边部向视网膜后极部发展，从而残留管状视野，疾病终末期由于视锥细胞同时受累造成患者中心视力和周边视力均丧失[12]。目前已经发现超过50种基因的100个位点与RP相关，其中约20%为常染色体隐性遗传，10%～20%为常染色体显性遗传，还有10%为X连锁隐性遗传，其余为无家族史的散发病例[13]。目前RP尚无法治愈，但是一些治疗方法已经进入试验阶段。第一类方法为基因替代治疗，针对Leber先天性黑矇进行的基因研究进展[14] 为RP基因治疗提供了一个很好的借鉴；第二类方法致力于减缓光感受器变性从而减缓病情的发展；第三类方法旨在通过建立新的光感受器细胞重塑视网膜功能。在这三类方法中，基因治疗是最理想的方法。但RP是一种多基因致病的疾病，目前已经检测到超过50种基因的3000种突变可以致病[15]。同时，疾病后期视锥细胞同样受累，而基因治疗尚无法解决如此庞大的基因问题以及视锥细胞受累的问题。一种更具有可实施性的治疗手段是利用光遗传学，即通过在变性的视网膜上表达光敏蛋白重建视网膜的感光功能。这种光敏蛋白必须能够独立且直接地将光信号转化为电信号，而不依赖于其他信号通路。ChR2就是这样一种光敏蛋白。
3 光遗传学和ChR2
广义上来讲，光遗传学是指一种将表达光敏蛋白的基因编码至靶神经元，通过光刺激控制这些靶细胞激活的方法[16]。光敏蛋白在靶细胞的主要表达方式包括以病毒为载体进行转染和转基因小鼠。该技术涉及的光敏蛋白主要包括两类：微生物视蛋白和动物视蛋白。有脊椎动物和无脊椎动物的光反应过程具有明显区别，虽然都使用视紫红质这种由视黄醛与7次跨膜的螺旋形视蛋白共价结合的蛋白，但对于有脊椎动物，光刺激激活视紫红质后启动G蛋白偶联受体激活下游酶链反应，导致环磷酸鸟苷（cGMP）水解和cGMP门控阳离子通道关闭，最终细胞超级化[17]。无脊椎动物虽然也使用G蛋白偶联受体，但在光刺激下直接导致瞬时受体电势通道的激活和细胞快速的去极化[18]。ChR是一种微生物视蛋白，同样属于光敏离子通道蛋白，最初从绿藻中分离而来，介导其趋光性[19-20]。ChR2是其中一种ChR的亚型，同样具有7次跨膜的螺旋形蛋白结构，主要吸收蓝光（最大吸收波长～470 nm），受到蓝光刺激时引起阳离子通道开放，出现峰值电流，迅速引起细胞去极化，随后进入静息状态，紧接着给予第二次光刺激时出现的电流峰值明显减小，但是在黑暗条件中等待数秒之后，峰值将恢复正常[21-24]。这种在适宜波长光刺激下引起细胞快速去极化的性质，使其成为研究神经元功能的重要工具。2005年开始，研究者们陆续将ChR2表达到神经元上，通过蓝光刺激引起细胞去极化，精确控制神经元的活化，从而研究其基本功能以及病理情况下的功能改变[25-29]。
4 ChR2与RP
此前研究者还只是将ChR2应用在神经元功能方面的研究，随后一些视网膜的研究者开始关注到这种光敏蛋白在重塑视网膜感光方面的潜力。2006年，Bi等[30]首先通过将ChR2表达在rd1小鼠的视网膜上成功重建了部分视功能。rd1小鼠是一种常用的RP动物模型，研究者将以腺相关病毒-2为载体的ChR2注入rd1小鼠的玻璃体腔，ChR2非特异性的表达在RGC，这些细胞在RP患者的光感受器死亡后还能存活多年[31]。该研究发现，这种方法可以使失去光感的视网膜重新感光，并能将这些光信号传导至视皮层。然而视网膜并非单纯传导光信号，过去的观点认为复杂的视觉信号由视觉中枢处理，而近年来的研究提示之前我们一直低估了视网膜对视觉信号的处理能力，一些复杂的视觉信号的整合编译在视网膜就完成了，例如物体运动、颜色、对比等视觉信号[32-33]。所以虽然在RGC上表达ChR2可以使视网膜感光，但是却遗失了视网膜对许多视觉信号的编译能力。于是，有研究者将ON双极细胞作为靶细胞，通过光遗传学的方法不仅使视网膜重获光感，而且重塑了部分视觉相关的行为[34-35]。当然，如果能恢复视网膜第一级神经元的光感，无疑将最大程度上重塑视觉功能，而且视锥细胞在失去感光功能后还能存活很长时间。基于此，已经有研究者通过光遗传学的方法使RP动物模型在光感受器的层面即重获光感，而且记录到了视网膜的一些重要的生理功能，如方向选择、明暗对比等[36-37]。但是考虑到在疾病的晚期，残存的光感受器数量极少[38] ；所以，重塑光感受器感光功能的临床意义还需要更深入的研究。
由于ChR2的发现时间早，对ChR2的认识和研究比较深入，所以目前大部分应用光遗传学重塑视网膜视觉功能的研究都围绕ChR2展开；但是除此之外，还有很多光敏蛋白也被应用于视觉重塑的研究。对黄光敏感的噬盐菌视紫红质同样是一种微生物视蛋白，被激活时引起氯离子通道开放，导致细胞功能抑制。研究者将该蛋白和ChR2分别表达至视网膜的OFF细胞和ON细胞，以更大程度上模拟自然条件下的光反应过程[39]。虽然相对于微生物视蛋白而言，动物视蛋白的结构和信号传导通路更复杂，但是研究者们仍不断尝试将其应用于视功能的重塑，例如黑视蛋白在视网膜神经元上的表达，可使rd1小鼠重塑部分视觉相关行为[40-41]。此外，研究者们还尝试将这些视蛋白表达于不同的视网膜神经元，甚至是分别表达在神经元的胞体和树突，以最大程度地重塑视网膜的视觉功能[42]。
5 问题和展望
虽然目前关于光遗传学在视功能重塑中的研究取得了令人瞩目的成果，也为RP这一类视网膜变性疾病提供了一种极具价值和前景的治疗方案，但是在运用过程中，我们需要密切监测可能出现的问题。首先，病毒作为基因载体注入玻璃体腔可能引起免疫反应和视网膜毒性[43]。此前一些关于视网膜疾病基因治疗的临床前研究和前期临床研究并未观察到视网膜转染导致的并发症[44]。两项在啮齿类动物视网膜上表达ChR2的长期研究也未观察到严重的并发症[45-46]。当然，在其他灵长类动物和人类视网膜上的试验数据也是必不可少的。此外，通过光遗传学重塑的视网膜感光系统依然无法完全模拟生理情况的视网膜功能。一方面，由于ChR2等光敏蛋白具有固定的感光域，只能被一定波长的光线激活；另一方面，虽然既往研究记录到利用光遗传学的方法可以使视网膜获得光感，并使实验动物一些视觉相关的行为重建，但是试验需要较高的光强度，而这在实际生活中很难达到。随着研究的不断深入，具有更高光敏度和更广感光域的ChR亚型被发现，为以后的研究提供了更多的可能[47-48]。
目前关于光遗传学的研究均还围绕着动物实验进行，如果要评估其在疾病治疗中的应用前景，在灵长类动物和人视网膜上的研究必不可少，而体外培养的视网膜为我们进一步的研究提供了可能[49]。总之，光遗传学的出现具有划时代的意义，大量研究也提示了其在RP治疗中的前景，但是在应用到临床之前仍需要对安全性和有效性进行大量长期的研究和观察。