光遗传学技术是一种将光学和遗传学技术相结合的新兴技术。其主要原理是应用遗传学方法将特异的视蛋白导入目标神经元, 再用相应波长或频率的光刺激视蛋白, 使神经元兴奋或抑制, 进而控制特定神经环路的活动, 最终起到调控实验动物生理活动和行为的作用。在视网膜色素变性、老年性黄斑变性等视网膜变性性疾病中, 应用光遗传学技术玻璃体腔或视网膜下注射视蛋白基因, 由外界给予相应的光照激活视蛋白, 模拟并代替视网膜光感受器功能, 可在一定程度上恢复患者视力。但其存在病毒转染有潜在风险、目标细胞的准确选择难以把握、治疗后视力分辨率能否恢复正常尚不确定等局限性。随着光敏感度更高、更易被激发的新型视蛋白和具有更高转染效率的病毒载体不断研发, 相信光遗传学技术将会应用在更多眼科领域。
引用本文： 沈雨濛, 邢怡桥, 沈吟. 光遗传学技术及其在视网膜变性性疾病治疗中的应用. 中华眼底病杂志, 2016, 32(3): 338-342. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.03.030 复制
光遗传学技术(Optogenetics)是一种将光学和遗传学技术结合起来的新兴技术[1]。通过遗传学方法将特异的视蛋白导入目标神经元，再用相应波长或频率的光刺激视蛋白，使神经元兴奋或抑制，进而控制特定神经环路的活动，最终起到调控实验动物生理活动和行为的作用[2]。与传统的药物刺激和电极电刺激技术相比，光遗传学技术可通过遗传学技术将视蛋白特异地转染入某一选定的细胞，从而实现对某一类型细胞特异的刺激；对实验动物的损伤小，产生的刺激是由视蛋白离子通道介导，其刺激将沿着神经通路本身的传导方向传递，更接近生理性的神经系统兴奋方式[3]；可通过表达不同的视蛋白而产生兴奋或抑制两种效果。光遗传学技术的发现为神经生物学领域的研究提供了崭新视角并得到了广泛应用[4]。尽管已有一系列研究运用光遗传学技术在动物模型上成功使其视力得到一定程度恢复，但其仍存在病毒转染有潜在风险、目标细胞的准确选择难以把握、治疗后视力分辨率能否恢复正常尚不确定等局限性[5]。现就光遗传学技术的基本原理及其在视网膜变性性疾病治疗研究中的应用现状作一综述。
1 视蛋白
光遗传学技术的核心部分为视蛋白，分为非动物视蛋白或微生物视蛋白(Ⅰ型视蛋白)和动物视蛋白(Ⅱ型视蛋白)两种类型。Ⅰ型视蛋白主要存在于原核生物中，为原核生物的趋光活动提供能量和光合作用；Ⅱ型视蛋白主要存在于真核生物中，主要作用是参与视觉产生的活动和高级动物的昼夜节律[6]。两种类型的视蛋白均具有7次跨膜蛋白螺旋结构，并均以视黄醛作为其发色团，与其结合为视紫红质，介导对光反应的产生。在光照下视黄醛由11-顺式视黄醛变构为全反式视黄醛，引起视紫红质的分解，产生对光反应。
目前用于光遗传学技术的Ⅰ型视蛋白结构简单、反应快，可作为精确的分子光敏组分，导入非光敏细胞后，可从时间和空间上来介导非光敏细胞。其主要包括细菌视紫红质(BR)、盐视紫红质(HR)、通道视紫红质(ChR)3种蛋白。BR是首个被鉴定，也是迄今为止被研究得最多的视蛋白。BR分子由248个氨基酸残基组成，蛋白分子在空间上折叠形成7次跨膜螺旋结构，N′端位于细胞膜外侧，C′端位于细胞膜内侧，螺旋结构基本垂直于细胞膜。每个BR蛋白在其细胞膜内侧216位的氨基酸残基上结合一个视黄醛生色团。BR的使用光谱范围宽，可被400～700 nm的光激发，具有高空间分辨率(5000 lines/mm)和高感光灵敏度(30～80 mJ/cm2)[7]。它在低氧条件下高表达于盐古细菌膜上，可把质子从细胞质转运到细胞外，从而使细胞超极化。HR与BR一样具有7次跨膜螺旋结构，但并不偶联G蛋白受体。最大吸收波长为570 nm，是由微生物视蛋白基因编码的一个光激活氯离子泵[8]。离子通道开闭原理与BR类似，但HR为氯离子泵。给予570 nm的黄光照射时，含HR的细胞会超极化。HR蛋白基因已成功在小鼠视网膜神经节细胞和离体的小鼠视锥细胞表达[9, 10]。ChR于1984年首次在单细胞植物绿藻中发现[11]。目前被广泛研究的是ChR2，它由737个氨基酸残基组成。与BR、HR相同，ChR2具有7次跨膜α螺旋结构，并通过席夫碱(亚胺或甲亚胺特性基团)与全反式视黄醛相连接。与其他7次跨膜蛋白质不同，ChR2不需要第二信使来开启离子通道，而是通过自身的变构来开放离子通道。被激发后，全反式视黄醛变构为13-顺式视黄醛，使ChR2上的非选择性阳离子通道开放，引起细胞的去极化[12]。ChR2基因已成功从莱茵衣藻中克隆，并成功表达在爪蟾卵母细胞和人胚肾293细胞系中[13]。兼具反应快速和光敏感性高以及在持续光照时不易失敏的理想ChR2仍然在探索中[14]。
Ⅱ型视蛋白近年来也逐渐运用于光遗传学技术中，目前研究较多的是视黑素(melanopsin)[15]。视黑素于1998年首次被发现，它是一种存在于哺乳动物视网膜中，与G蛋白耦联的光敏色素。由OPN4基因编码，在视网膜中主要存在于感光神经节细胞中，在瞳孔对光反射和调控昼夜节律中起重要作用[16]。仅0.11%~0.55%的视锥细胞中有视黑素的表达，而且大部分这类视锥细胞都位于视网膜周边[17]。视黑素可被467 nm的蓝光激发，通过与Gq亚型的G蛋白耦联，可使下游的瞬时感受器电位通道开放，从而使钙离子进入细胞，在几十秒的短时间内使细胞兴奋[18]。与ChR2比较，因视黑素本身即存在哺乳动物视网膜内，故可被自然光线激发，并且在长时间激发下不易失活[19]；而ChR2需要短波长强激光激发，易被漂白而失活[20]。更重要的是，视黑素作为光敏蛋白导入目标细胞后，可以在生理水平上发挥作用，视网膜原有的信号通路及调控因子均可对其进行调节[21]；而ChR2作为异种蛋白不具备这种特性。并且已有研究表明，将视黑素异位表达于非感光神经节细胞中时，视黑素将表现更高的光敏感性和更长的激活时间[22]。
2 在目标细胞中表达视蛋白
光遗传学技术的第2个关键问题在于将微生物视蛋白基因转入并表达。目前主流方法有转染、病毒转导、转基因动物。
转染即将外源性DNA插入目标细胞或细胞系的过程。主要分为化学转染法和物理转染法。化学转染法包括二乙氨乙基-葡聚糖法、磷酸钙和人工脂质体法；物理转染法包括显微注射、电穿孔、基因枪等。转染的优点在于它未向目标细胞中引入人类及动植物病原体、寄生动物病及毒素等生物制剂，所以相对而言较为安全；但其局限是在宿主细胞中的表达效率较低，并且在体动物中的转染仍然存在技术上的困难[14]。
病毒转导是光遗传学技术中应用最普遍的基因转入方法，具体方法是将含有视蛋白基因的重组病毒注入在体动物特定的组织以使视蛋白表达在目标细胞或组织内。该技术中主要应用的病毒有腺病毒、逆转录酶病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)等[23]。目前主要应用于光遗传学技术的是AAV。但AAV的局限性在于导入基因长度不能过长，基因的启动子不能超过4 kb，并且启动子需要非常精确、高效[24]；向活体动物体内注入外源性病毒，有可能会引起不可预计的免疫反应，影响实验结果。
转基因动物目前在光遗传学技术中广泛使用。Arenkiel等[25]通过转基因的方法使ChR-YFP在小鼠中表达。同样应用于光遗传学技术中的转基因动物还有斑马鱼、果蝇和灵长类动物[26-28]。Weick等[29]在人胚胎干细胞诱导出的神经元中成功表达了ChR2基因。转基因动物的优势在于转入基因的表达量会随着动物的生长而增加，当动物达到一定年龄时，转入的视蛋白表达含量将相当可观。但其困难在于，如果将基因表达在如脑部这样的深部组织，用来激发ChR2的蓝光将无法达到脑部深处[30]。但是对于激发相对浅层的视网膜上表达蛋白在理论上不存在困难。
3 光遗传学技术在视网膜变性性疾病治疗中的应用
由于光感受器异常导致视力下降甚至失明的一类疾病在眼科尚无特效药和有效的手术方法。最常见的是视网膜色素变性(RP)、类RP，其病因为视紫红质基因突变[31]。这类疾病还包括视网膜色素上皮紊乱导致的Leber先天性黑矇、三磷酸腺苷结合转运蛋白异常引起的Stargardt病、老年性黄斑变性等[32-35]。这类疾病的共同特征是，在疾病早期仅仅表现为部分光感受器细胞功能的损伤，而二级神经元双极细胞和三级神经元神经节细胞均正常，患者仅表现为暗适应受损和(或)管状视力等，并且大部分患者将在这一阶段持续较长的时间。如果在这一阶段能恢复光感受器细胞的功能，即可使患者的视力得到提升甚至恢复，并能阻止疾病的进一步发展，防止视网膜出现不可逆的神经元及神经胶质的重塑和异常神经突触的生成[36]。视蛋白的发现和光遗传学技术的发展为研究和治疗这一系列由于光感受器细胞异常所致的视网膜疾病提供了新的方法和方向。
目前广泛运用于光遗传学技术的小鼠模型是rd模型小鼠[37]。Rd模型小鼠是一种Pde6b基因缺失，使其在出生后10 d起视网膜便开始出现视杆细胞凋亡，至3周时视杆细胞全部凋亡，随后视锥细胞开始凋亡，直到视力完全丧失约1年时间[38]。Rd模型小鼠很好的模拟了RP等一系列以光感受器细胞受损为早期表现，发展较缓慢，最终以神经元和神经胶质细胞的异常增生和分布等视网膜不可逆的重塑、视力丧失为主要表现的疾病[37]。加之rd模型小鼠繁殖较快，已是科学研究中广泛使用的实验模型小鼠，是光遗传学技术研究的良好模型。Lagali等[39]研究表明，在处于RP初期的rd1小鼠中用AAV将ChR2基因转入后，可在去极化型(ON型)双极细胞的树突处成功表达，从而使小鼠的视力得到提升。Lin等[22]将视黑素用AAV导入rd1小鼠非感光神经节细胞中，发现视黑素可在非感光神经节细胞中正常表达，并且能使非感光神经节细胞具有感光功能，进而使小鼠的视力得到一定程度恢复；同时还发现将视黑素异位表达于非感光神经节细胞中时，视黑素会表现更高的光敏感性和更长的激活时间。而当rd1小鼠处于RP晚期时，光感受器细胞和双极细胞大量损伤，残存的神经节细胞功能异常。目前尚无研究表明可在处于此期的模型中成功转入视蛋白并使视功能得到恢复。提示当患者处于疾病早期时，视网膜仅存在光感受器细胞的损伤，其他下级的神经元结构及功能尚正常，及时采取光遗传学技术将外源视蛋白基因导入病变的光感受器细胞或者下一级的神经元细胞，便可通过外界给予光照来激活导入的视蛋白，代替光感受器细胞的作用，使光信号的传导得以完成，从而使患者恢复视觉。
4 光遗传学技术在眼科临床应用的局限性和展望
尽管目前临床前期研究尚未发现应用光遗传学技术对视网膜进行病毒转染时对实验动物有严重影响；但通过长期观察发现，当在小鼠大脑皮质中高水平转入ChR2后可见异常的细胞形态和细胞连接[40]。在灵长类实验动物进行的病毒转染仍然缺乏成功的报道，并且病毒转染仍可能存在着未被发现的其他不利影响。这些都阻碍着病毒转染在临床中广泛应用。
Busskamp等[10]成功将HR表达在小鼠的视锥细胞中。然而选择光感受器细胞作为病毒转染目标细胞的最主要缺点是RP晚期视锥细胞只存在于黄斑处，即使将视蛋白转入视锥细胞也仅仅能弥补黄斑处的视力，结果与处于中期RP所表现的管状视力十分相似[41]。而且在其他的视网膜营养障碍性疾病中，光感受器细胞往往已受到损害，无法导入视蛋白。
于是研究者们将目标细胞转向光感受器细胞的下一级神经元细胞双极细胞。由于双极细胞分为ON型和超极化型(OFF型)两类，所以不可能仅将一种单一的视蛋白转入所有双极细胞，同时产生这两种对光反应；而需要特异性的将具有去极化作用的视蛋白导入ON型双极细胞，将具有超极化作用的视蛋白导入OFF型双极细胞。Lagali等[39]成功将ChR2特异地表达在rd1小鼠的ON型双极细胞上。Doroudchi等[42]成功将ChR2表达在rd6和rd10小鼠模型的ON型双极细胞上。由于ChR2需要较高的光照强度，Kleinlogel等[43]通过改造ChR2得到了对光照更加敏感的突变体CatCh，成功解决了这一问题。然而，如果选择双极细胞作为目标细胞，仍然会受到光感受器细胞损伤所导致的其在解剖位置上的重塑、生理功能的紊乱和病理性连接的大量产生等影响。
研究者试图绕过受损的视网膜内层，直接将视蛋白转入神经节细胞，但结果并不令人满意。Thyagarajan等[44]将ChR2转入rd1小鼠神经节细胞，虽然ChR2在40%的神经节细胞中表达，但转入ChR2的小鼠视觉功能与未转入小鼠相比并未提高。原因可能是未将生理情况下ON型和OFF型双极细胞传入的光信号区分开，而目前特异性地将视蛋白转入ON型或OFF型的神经节细胞这一技术尚未成熟。视黑素的发现较好的解决了这一问题，将视黑素导入神经节细胞，可使神经节细胞获得感光能力，使小鼠的视力得到恢复[45]。目前关于视黑素在光遗传学技术中的研究仅限于小鼠，尚无在更高级动物中的实验。也尚无对转染后动物视觉的分辨率是否能恢复到正常水平进行研究。
光遗传学技术的发展显示了交叉学科研究的潜力与生命科学新研究方法的重要性，为眼科领域的研究打开了新的大门，为许多目前无法治愈的眼部疾病提供了新的思路，拥有巨大的应用前景。并且，光遗传学技术还在不断优化，光敏感度更高、更易被激发的新型视蛋白和具有更高转染效率的病毒载体正不断被研发。光遗传学技术在时间和空间上的优越性使得该项技术在多种动物模型中广泛应用，相信光遗传学技术将会应用在更多眼科领域，并取得更多成果造福人类。
光遗传学技术(Optogenetics)是一种将光学和遗传学技术结合起来的新兴技术[1]。通过遗传学方法将特异的视蛋白导入目标神经元，再用相应波长或频率的光刺激视蛋白，使神经元兴奋或抑制，进而控制特定神经环路的活动，最终起到调控实验动物生理活动和行为的作用[2]。与传统的药物刺激和电极电刺激技术相比，光遗传学技术可通过遗传学技术将视蛋白特异地转染入某一选定的细胞，从而实现对某一类型细胞特异的刺激；对实验动物的损伤小，产生的刺激是由视蛋白离子通道介导，其刺激将沿着神经通路本身的传导方向传递，更接近生理性的神经系统兴奋方式[3]；可通过表达不同的视蛋白而产生兴奋或抑制两种效果。光遗传学技术的发现为神经生物学领域的研究提供了崭新视角并得到了广泛应用[4]。尽管已有一系列研究运用光遗传学技术在动物模型上成功使其视力得到一定程度恢复，但其仍存在病毒转染有潜在风险、目标细胞的准确选择难以把握、治疗后视力分辨率能否恢复正常尚不确定等局限性[5]。现就光遗传学技术的基本原理及其在视网膜变性性疾病治疗研究中的应用现状作一综述。
1 视蛋白
光遗传学技术的核心部分为视蛋白，分为非动物视蛋白或微生物视蛋白(Ⅰ型视蛋白)和动物视蛋白(Ⅱ型视蛋白)两种类型。Ⅰ型视蛋白主要存在于原核生物中，为原核生物的趋光活动提供能量和光合作用；Ⅱ型视蛋白主要存在于真核生物中，主要作用是参与视觉产生的活动和高级动物的昼夜节律[6]。两种类型的视蛋白均具有7次跨膜蛋白螺旋结构，并均以视黄醛作为其发色团，与其结合为视紫红质，介导对光反应的产生。在光照下视黄醛由11-顺式视黄醛变构为全反式视黄醛，引起视紫红质的分解，产生对光反应。
目前用于光遗传学技术的Ⅰ型视蛋白结构简单、反应快，可作为精确的分子光敏组分，导入非光敏细胞后，可从时间和空间上来介导非光敏细胞。其主要包括细菌视紫红质(BR)、盐视紫红质(HR)、通道视紫红质(ChR)3种蛋白。BR是首个被鉴定，也是迄今为止被研究得最多的视蛋白。BR分子由248个氨基酸残基组成，蛋白分子在空间上折叠形成7次跨膜螺旋结构，N′端位于细胞膜外侧，C′端位于细胞膜内侧，螺旋结构基本垂直于细胞膜。每个BR蛋白在其细胞膜内侧216位的氨基酸残基上结合一个视黄醛生色团。BR的使用光谱范围宽，可被400～700 nm的光激发，具有高空间分辨率(5000 lines/mm)和高感光灵敏度(30～80 mJ/cm2)[7]。它在低氧条件下高表达于盐古细菌膜上，可把质子从细胞质转运到细胞外，从而使细胞超极化。HR与BR一样具有7次跨膜螺旋结构，但并不偶联G蛋白受体。最大吸收波长为570 nm，是由微生物视蛋白基因编码的一个光激活氯离子泵[8]。离子通道开闭原理与BR类似，但HR为氯离子泵。给予570 nm的黄光照射时，含HR的细胞会超极化。HR蛋白基因已成功在小鼠视网膜神经节细胞和离体的小鼠视锥细胞表达[9, 10]。ChR于1984年首次在单细胞植物绿藻中发现[11]。目前被广泛研究的是ChR2，它由737个氨基酸残基组成。与BR、HR相同，ChR2具有7次跨膜α螺旋结构，并通过席夫碱(亚胺或甲亚胺特性基团)与全反式视黄醛相连接。与其他7次跨膜蛋白质不同，ChR2不需要第二信使来开启离子通道，而是通过自身的变构来开放离子通道。被激发后，全反式视黄醛变构为13-顺式视黄醛，使ChR2上的非选择性阳离子通道开放，引起细胞的去极化[12]。ChR2基因已成功从莱茵衣藻中克隆，并成功表达在爪蟾卵母细胞和人胚肾293细胞系中[13]。兼具反应快速和光敏感性高以及在持续光照时不易失敏的理想ChR2仍然在探索中[14]。
Ⅱ型视蛋白近年来也逐渐运用于光遗传学技术中，目前研究较多的是视黑素(melanopsin)[15]。视黑素于1998年首次被发现，它是一种存在于哺乳动物视网膜中，与G蛋白耦联的光敏色素。由OPN4基因编码，在视网膜中主要存在于感光神经节细胞中，在瞳孔对光反射和调控昼夜节律中起重要作用[16]。仅0.11%~0.55%的视锥细胞中有视黑素的表达，而且大部分这类视锥细胞都位于视网膜周边[17]。视黑素可被467 nm的蓝光激发，通过与Gq亚型的G蛋白耦联，可使下游的瞬时感受器电位通道开放，从而使钙离子进入细胞，在几十秒的短时间内使细胞兴奋[18]。与ChR2比较，因视黑素本身即存在哺乳动物视网膜内，故可被自然光线激发，并且在长时间激发下不易失活[19]；而ChR2需要短波长强激光激发，易被漂白而失活[20]。更重要的是，视黑素作为光敏蛋白导入目标细胞后，可以在生理水平上发挥作用，视网膜原有的信号通路及调控因子均可对其进行调节[21]；而ChR2作为异种蛋白不具备这种特性。并且已有研究表明，将视黑素异位表达于非感光神经节细胞中时，视黑素将表现更高的光敏感性和更长的激活时间[22]。
2 在目标细胞中表达视蛋白
光遗传学技术的第2个关键问题在于将微生物视蛋白基因转入并表达。目前主流方法有转染、病毒转导、转基因动物。
转染即将外源性DNA插入目标细胞或细胞系的过程。主要分为化学转染法和物理转染法。化学转染法包括二乙氨乙基-葡聚糖法、磷酸钙和人工脂质体法；物理转染法包括显微注射、电穿孔、基因枪等。转染的优点在于它未向目标细胞中引入人类及动植物病原体、寄生动物病及毒素等生物制剂，所以相对而言较为安全；但其局限是在宿主细胞中的表达效率较低，并且在体动物中的转染仍然存在技术上的困难[14]。
病毒转导是光遗传学技术中应用最普遍的基因转入方法，具体方法是将含有视蛋白基因的重组病毒注入在体动物特定的组织以使视蛋白表达在目标细胞或组织内。该技术中主要应用的病毒有腺病毒、逆转录酶病毒、慢病毒和腺相关病毒(AAV)等[23]。目前主要应用于光遗传学技术的是AAV。但AAV的局限性在于导入基因长度不能过长，基因的启动子不能超过4 kb，并且启动子需要非常精确、高效[24]；向活体动物体内注入外源性病毒，有可能会引起不可预计的免疫反应，影响实验结果。
转基因动物目前在光遗传学技术中广泛使用。Arenkiel等[25]通过转基因的方法使ChR-YFP在小鼠中表达。同样应用于光遗传学技术中的转基因动物还有斑马鱼、果蝇和灵长类动物[26-28]。Weick等[29]在人胚胎干细胞诱导出的神经元中成功表达了ChR2基因。转基因动物的优势在于转入基因的表达量会随着动物的生长而增加，当动物达到一定年龄时，转入的视蛋白表达含量将相当可观。但其困难在于，如果将基因表达在如脑部这样的深部组织，用来激发ChR2的蓝光将无法达到脑部深处[30]。但是对于激发相对浅层的视网膜上表达蛋白在理论上不存在困难。
3 光遗传学技术在视网膜变性性疾病治疗中的应用
由于光感受器异常导致视力下降甚至失明的一类疾病在眼科尚无特效药和有效的手术方法。最常见的是视网膜色素变性(RP)、类RP，其病因为视紫红质基因突变[31]。这类疾病还包括视网膜色素上皮紊乱导致的Leber先天性黑矇、三磷酸腺苷结合转运蛋白异常引起的Stargardt病、老年性黄斑变性等[32-35]。这类疾病的共同特征是，在疾病早期仅仅表现为部分光感受器细胞功能的损伤，而二级神经元双极细胞和三级神经元神经节细胞均正常，患者仅表现为暗适应受损和(或)管状视力等，并且大部分患者将在这一阶段持续较长的时间。如果在这一阶段能恢复光感受器细胞的功能，即可使患者的视力得到提升甚至恢复，并能阻止疾病的进一步发展，防止视网膜出现不可逆的神经元及神经胶质的重塑和异常神经突触的生成[36]。视蛋白的发现和光遗传学技术的发展为研究和治疗这一系列由于光感受器细胞异常所致的视网膜疾病提供了新的方法和方向。
目前广泛运用于光遗传学技术的小鼠模型是rd模型小鼠[37]。Rd模型小鼠是一种Pde6b基因缺失，使其在出生后10 d起视网膜便开始出现视杆细胞凋亡，至3周时视杆细胞全部凋亡，随后视锥细胞开始凋亡，直到视力完全丧失约1年时间[38]。Rd模型小鼠很好的模拟了RP等一系列以光感受器细胞受损为早期表现，发展较缓慢，最终以神经元和神经胶质细胞的异常增生和分布等视网膜不可逆的重塑、视力丧失为主要表现的疾病[37]。加之rd模型小鼠繁殖较快，已是科学研究中广泛使用的实验模型小鼠，是光遗传学技术研究的良好模型。Lagali等[39]研究表明，在处于RP初期的rd1小鼠中用AAV将ChR2基因转入后，可在去极化型(ON型)双极细胞的树突处成功表达，从而使小鼠的视力得到提升。Lin等[22]将视黑素用AAV导入rd1小鼠非感光神经节细胞中，发现视黑素可在非感光神经节细胞中正常表达，并且能使非感光神经节细胞具有感光功能，进而使小鼠的视力得到一定程度恢复；同时还发现将视黑素异位表达于非感光神经节细胞中时，视黑素会表现更高的光敏感性和更长的激活时间。而当rd1小鼠处于RP晚期时，光感受器细胞和双极细胞大量损伤，残存的神经节细胞功能异常。目前尚无研究表明可在处于此期的模型中成功转入视蛋白并使视功能得到恢复。提示当患者处于疾病早期时，视网膜仅存在光感受器细胞的损伤，其他下级的神经元结构及功能尚正常，及时采取光遗传学技术将外源视蛋白基因导入病变的光感受器细胞或者下一级的神经元细胞，便可通过外界给予光照来激活导入的视蛋白，代替光感受器细胞的作用，使光信号的传导得以完成，从而使患者恢复视觉。
4 光遗传学技术在眼科临床应用的局限性和展望
尽管目前临床前期研究尚未发现应用光遗传学技术对视网膜进行病毒转染时对实验动物有严重影响；但通过长期观察发现，当在小鼠大脑皮质中高水平转入ChR2后可见异常的细胞形态和细胞连接[40]。在灵长类实验动物进行的病毒转染仍然缺乏成功的报道，并且病毒转染仍可能存在着未被发现的其他不利影响。这些都阻碍着病毒转染在临床中广泛应用。
Busskamp等[10]成功将HR表达在小鼠的视锥细胞中。然而选择光感受器细胞作为病毒转染目标细胞的最主要缺点是RP晚期视锥细胞只存在于黄斑处，即使将视蛋白转入视锥细胞也仅仅能弥补黄斑处的视力，结果与处于中期RP所表现的管状视力十分相似[41]。而且在其他的视网膜营养障碍性疾病中，光感受器细胞往往已受到损害，无法导入视蛋白。
于是研究者们将目标细胞转向光感受器细胞的下一级神经元细胞双极细胞。由于双极细胞分为ON型和超极化型(OFF型)两类，所以不可能仅将一种单一的视蛋白转入所有双极细胞，同时产生这两种对光反应；而需要特异性的将具有去极化作用的视蛋白导入ON型双极细胞，将具有超极化作用的视蛋白导入OFF型双极细胞。Lagali等[39]成功将ChR2特异地表达在rd1小鼠的ON型双极细胞上。Doroudchi等[42]成功将ChR2表达在rd6和rd10小鼠模型的ON型双极细胞上。由于ChR2需要较高的光照强度，Kleinlogel等[43]通过改造ChR2得到了对光照更加敏感的突变体CatCh，成功解决了这一问题。然而，如果选择双极细胞作为目标细胞，仍然会受到光感受器细胞损伤所导致的其在解剖位置上的重塑、生理功能的紊乱和病理性连接的大量产生等影响。
研究者试图绕过受损的视网膜内层，直接将视蛋白转入神经节细胞，但结果并不令人满意。Thyagarajan等[44]将ChR2转入rd1小鼠神经节细胞，虽然ChR2在40%的神经节细胞中表达，但转入ChR2的小鼠视觉功能与未转入小鼠相比并未提高。原因可能是未将生理情况下ON型和OFF型双极细胞传入的光信号区分开，而目前特异性地将视蛋白转入ON型或OFF型的神经节细胞这一技术尚未成熟。视黑素的发现较好的解决了这一问题，将视黑素导入神经节细胞，可使神经节细胞获得感光能力，使小鼠的视力得到恢复[45]。目前关于视黑素在光遗传学技术中的研究仅限于小鼠，尚无在更高级动物中的实验。也尚无对转染后动物视觉的分辨率是否能恢复到正常水平进行研究。
光遗传学技术的发展显示了交叉学科研究的潜力与生命科学新研究方法的重要性，为眼科领域的研究打开了新的大门，为许多目前无法治愈的眼部疾病提供了新的思路，拥有巨大的应用前景。并且，光遗传学技术还在不断优化，光敏感度更高、更易被激发的新型视蛋白和具有更高转染效率的病毒载体正不断被研发。光遗传学技术在时间和空间上的优越性使得该项技术在多种动物模型中广泛应用，相信光遗传学技术将会应用在更多眼科领域，并取得更多成果造福人类。