引用本文： 刘诗亮, 沈吟, 陈媛媛, 胡单萍, 田凯琳, 陈长征, 邢怡桥. 新型Micron Ⅳ视网膜影像系统在三种小鼠疾病模型中的应用. 中华眼底病杂志, 2014, 30(3): 294-298. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.03.016 复制
目前，临床上开展各项影像和功能检查平台已经日趋成熟。然而，动物眼科研究工具的开发略显滞后。小动物眼球极小，且与人眼比较存在屈光系数不同。所以，用于人眼的影像和功能检查仪器难于捕捉到清晰的小鼠眼底血管形态图像以及电生理数据。从最初的视网膜成像显微镜开始，Micron技术不断开发创新的动物眼科研究工具，整合成为成熟的实验室一体化研究平台。本研究采用最新的Micron Ⅳ全功能小动物视网膜活体影像系统，利用明场视网膜成像、荧光素眼底血管造影(FFA)、光相干断层扫描(OCT)以及视网膜电图(ERG)等技术对氧诱导视网膜病变(OIR)、N-甲基-N-亚硝脲(MNU)致视网膜光感受器细胞变性、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜神经节细胞(RGC)急性损伤3种不同的疾病模型小鼠进行检查，分析评价其应用效果。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康雄性C57BL/6J小鼠24只。其中，7日龄6只； 6周龄15只；12月龄3只。清洁级。武汉大学实验动物中心提供。动物饲养和使用遵照实验动物使用的有关规定。
采用抛硬币法将7日龄小鼠随机分为正常对照组和OIR模型组，每组3只小鼠。参照文献[1]的方法建立OIR模型，将小鼠与哺乳母鼠放于自制的密闭氧箱内，控制氧箱内氧气流量在0.5～1.0 L/min，温度维持在25 ℃左右，用测氧仪(CY-12C型，建德市梅城电化分析仪器厂)持续监测氧浓度为(75±2)%。每天观察其生长情况并交替将哺乳母鼠置于正常环境中观察6～8 h后再放回氧箱。小鼠连续吸高浓度氧饲养5 d后，再置于正常氧环境中饲养5 d。正常对照组小鼠置于正常环境温度下饲养至17日龄。
6周龄C57BL/6J小鼠6只，采用抛硬币法随机分为对照组和MNU模型组，每组3只小鼠。新鲜无菌生理盐水配制1%的MNU(美国Sigma公司)，工作液含有0.05%醋酸，避光4 ℃保存。参照文献[2]的方法按体重60 mg/kg的剂量一次腹腔注射建立MNU模型。对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。
6周龄C57BL/6J小鼠6只，右眼参照文献[3]的方法并适当改进建立NMDA模型(NMDA模型组)。小鼠全身麻醉后，眼表10%碘酊消毒。手术显微镜下，于颞侧角巩膜缘1 mm处用32G针头刺穿，10 μl微量注射器(美国Hamilton公司)注入浓度为10 mmol/L的NMDA(美国Sigma公司) 3 μl，手术结束时结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。左眼(对照组)玻璃体腔注射相同体积的磷酸盐缓冲液。
应用Micron Ⅳ视网膜影像系统(美国Phoenix Research Labs公司)对17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组、NMDA模型组小鼠行眼底彩色照相检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组小鼠行FFA检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组小鼠行OCT检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，MNU模型组建模后1、2、3 d和对照组小鼠，NMDA模型组建模后12、24 h和对照组小鼠行ERG检查。
检查时，小鼠搁置于设备配套的小动物台上，全身麻醉后剪去鼠须，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，并在整个操作过程中用羟丙甲纤维素滴眼液湿润角膜，保证屈光间质透明。眼底彩色照相时，小鼠暴露鼠眼并调整镜头方向，直至视网膜目标血管在屏幕清晰可见，在统一的测量参数下拍摄彩色眼底像。OCT检查时，在可视化的明场下，对眼底进行线性水平扫描，10 000 ～ 20 000 A扫描/s，调节接收器增益，经降噪平均后获取OCT图像，横向、纵向分辨率均为2 μm。FFA检查时，按体重0.001 ml/g剂量腹腔注射10%荧光素钠(美国Alcon公司)，1 s内注射完毕。从注射开始计时，摄像机拍摄设置为4帧／s，直至5 min，以后间隔10 min进行1次眼底照相，直至荧光消失。ERG检查时，小鼠暗适应24 h后，于暗室内弱红光照明下进行操作。全身麻醉后，将参考电极和接地电极分别插入到两耳之间和尾根部皮下，用眼科粘弹剂涂抹眼球表面保护角膜和降低干扰，移动金属试验台后微调，使角膜和金属环形记录电极接触，金属试验台与放大器接地线。通过强度为80 Hz的单色光(绿光)刺激闪光模式，间隔10 s进行一次数据采集。同一眼连续测定5次，记录并打印图形。
采用SPSS 13.0统计软件行统计学分析处理。实验数据以均数±标准差(
2 结果
不同年龄段正常小鼠视网膜结构均清晰，视盘位于眼球后部中央，沿视盘发出1只细且直的动脉，伴行8只较粗的视网膜静脉，未见黄斑样结构，无渗出和出血(图 1)。FFA检查结果显示，3～8 s可见视网膜动脉显影，9～20 s后图像清晰，可见眼底1级血管充盈显影；21 s～5 min后可见稀疏的小动脉分支形成的浅层毛细血管网；小静脉汇集成的视网膜静脉；视网膜小血管最小到4级血管均可显像；5 min后背景荧光逐渐变亮，眼底血管走形和轮廓清晰程度能够持续到2 h。显示视网膜血管分布均匀，走行自然。深浅两层血管网清晰可见，深层血管呈多边形网状结构，浅层血管呈放射状分布(图 2)。OCT检查可观察到明显的视网膜分层且结构分明，ERG波形稳定。
OIR 模型组小鼠视网膜血管高度扩张、纡曲，走形僵直，隐约可见暗红色血管网(图 3A)。FFA检查可见后极部无血管灌注区，中周部形态异常、分布紊乱的新生血管丛，荧光渗漏致玻璃体腔混浊(图 3B)。OCT检查可见视网膜前纤维血管组织及纡曲扩张血管后方粗大的阴影暗区(图 3C)。
MNU 模型组小鼠视盘呈蜡黄色萎缩，视网膜颜色灰暗但无明显色素性改变(图 4)。FFA检查可见视网膜血管轻微变细，无明显荧光强度或分布的异常(图 5)。OCT检查可见视网膜厚度正常，结构变化不明显(图 6)。ERG检查结果显示，正常对照组小鼠a、b波潜伏期分别为(28.05±4.08)、(47.35±6.72) ms，最大混合反应a波振幅为(51.88±3.66) μV。MNU模型组小鼠建模后1、2、3 d,a波潜伏期分别为(28.16±3.41)、(29.67±2.60)、(32.90±4.27) ms，b波潜伏期分别为(48.35±4.17)、(47.71±4.35)、(53.02±5.09) ms。a、b波潜伏期变化不明显(图 7)。建模后1、2、3 d，最大混合反应a波振幅分别为(48.87±4.43)、(15.38±4.36)、(13.78±5.52) μV。建模后2、3 d，最大混合反应a波振幅明显下降，下降幅度与建模时间呈正比。建模后2、3 d最大混合反应a波振幅分别与正常组小鼠比较，差异有统计学意义(t=7.650、32.000，P<0.01)。
图1
正常小鼠右眼彩色眼底像。1A～1C.分别为正常对照组，6周龄、12月龄小鼠彩色眼底像。视网膜结构清晰，视盘位于眼球后部中央，沿视盘发出1只细且直的动脉，伴行8只较粗的视网膜静脉，未见黄斑样结构，无渗出和出血 图 2 正常小鼠右眼FFA像。2A～2C.分别正常对照组，6周龄、12个月龄小鼠FFA像。视网膜结构清晰，血管行径正常，荧光充盈均匀，无渗漏 图 3 OIR模型小鼠彩色眼底像、FFA像、水平扫描OCT像。3A.彩色眼底像，视网膜血管高度扩张、纡曲，走形僵直(黑箭)；3B.FFA像，可见形态异常、分布紊乱的新生血管丛(黑箭)，荧光渗漏致玻璃体腔混浊；3C.OCT像，视网膜前纤维血管组织及纡曲扩张血管后方粗大的阴影暗区(白箭) 图 4 MNU模型组小鼠彩色眼底像。视盘呈蜡黄色萎缩 图 5 MNU模型组小鼠FFA像。视网膜血管轻微变细 图 6 MNU模型组小鼠OCT像。视网膜厚度和结构未见改变
图7
MNU模型组小鼠建模后ERG像。7A～7C.分别为建模后1、2、3 d。a、b波潜伏期变化不大；建模后2、3 d最大混合反应a波振幅明显下降(黑箭)
NMDA模型组小鼠视网膜呈苍白色改变，血管痉挛纡曲(图 8)。ERG检查结果显示，NMDA模型组小鼠建模后12、24 h，a波潜伏期分别为(31.84±5.70)、(38.71±6.62) ms，b波潜伏期分别为(44.29±4.62)、(54.86±7.53) ms。a、b波潜伏期变化不明显。正常对照组小鼠最大混合反应b波振幅为(144.40±15.76) μV。NMDA模型组小鼠建模后12、24 h，最大混合反应b波振幅分别为(72.28±7.18)、(65.35±9.18) μV。NMDA模型组小鼠最大混合反应b波振幅明显下降(图 9)，与对照组小鼠最大混合反应b波振幅比较，差异有统计学意义(t=5.123、5.992，P<0.05)。
图8
NMDA模型组小鼠彩色眼底像。8A、8B分别为建模后12、24 h，视网膜呈苍白色改变，血管痉挛纡曲(白箭) 图 9 NMDA模型组小鼠 ERG像。9A、9B分别为建模后12、24 h。最大混合反应b波振幅下降较为明显(黑箭)
3 讨论
眼底疾病种类多样，许多发病机制不明，缺乏有效的治疗方法。因此，建立相应的动物模型对揭示各种眼底疾病的发病机制，探讨疾病的诊断、治疗及预防方法均具有重要意义。本研究应用最新的Micron Ⅳ视网膜影像系统，利用眼底彩色照相、FFA、OCT以及ERG技术对3种常用且具有代表性的小鼠眼科疾病模型进行了无创、实时的分析及评价。探索Micron Ⅳ技术平台在眼科基础研究中的应用价值，以期为今后的研究提供新的思路和手段。
OIR小鼠模型是一种常用的视网膜新生血管模型[1, 4]。既往视网膜新生血管的多少主要通过病理学切片或视网膜铺片中血管造影染色来判断[5]。本研究应用Micron Ⅳ在活体水平上对其进行观察，发现模型组与对照组在视网膜血管形态结构上存在显著差异。整个实验操作过程简单、快捷，图像清晰可靠。证实Micron Ⅳ为眼科研究中动态、持续获取同一动物的活体视网膜影像数据创造了条件。
作为一种烷基化衍生物，MNU可以诱导多种动物视网膜变性[6, 7]，且单次腹腔给药能在1周内造成严重的光感受器细胞损害。导致ERG中起源于视网膜光感受器和色素上皮细胞的a波振幅明显下降，本研究ERG检查结果与既往的文献报道结果一致[8]。且实验结果表明，电生理功能检查比形态学改变更加敏感。进一步证实Micron Ⅳ可实现小动物视网膜功能的精确测量，灵活设定刺激光波长、能量、闪频和脉冲宽度等。
RGC凋亡常见于青光眼和视网膜动脉阻塞等多种视网膜的神经退行性疾病[9]。玻璃体腔注射的NMDA可通过激活视网膜细胞膜上NMDA型谷氨酸受体,导致大量的钙离子内流,随后激活凋亡前信号级联反应，导致神经元的兴奋性毒性损伤[10]。本研究提供了玻璃体腔注射NMDA诱导的急性RGC兴奋毒性损伤在小鼠模型上的建立方法，并进一步利用Micron Ⅳ观察了造模后的结构和功能损伤。结果显示，NMDA模型组小鼠b波波幅出现明显下降。由于b波起源于视网膜内层，与视网膜双极细胞有关。 因此，我们推测可能的原因是双极细胞作为神经节细胞的上游神经元也受到一定的损伤，导致b波振幅的下降。
Micron设备是专为小型实验动物眼球成像而开发的高技术眼科学研究综合平台系统，检查结果被公认为小动物视网膜影像的新标准[11, 12]。其优点在于：(1)上手操作快，无需特殊的实验准备。(2)采用专为小动物设计的视网膜影像撷取系统，更易寻找和观察病变区域。(3)配备小动物操作台可避免人为干扰，结果更稳定。(4)Micron Ⅳ在基本系统平台上可以快速扩展其他功能，此类模式具有重要应用价值。最新一代Micron Ⅳ平台在之前的基础上配备多项扩展功能，覆盖了眼球形态学、功能研究以及激光注入研究等。可选模块包括视网膜显微成像系统、激光注射引导及激光器、高分辨率OCT、裂隙灯成像系统和电生理ERG等。能更加方便清晰地获得小鼠的眼底彩色像和FFA、OCT、ERG图像，为眼科实验动物造模及指标检测提供了极大的便利。此外，Micron Ⅳ可选择多种滤光片或近红外接收系统，提供普通明场、荧光素、伊凡思蓝血管造影以及荧光图像4种成像方式。最先进的的低噪音三芯片CCD相机作为一种高灵敏度感应器，可以捕捉很微弱的荧光，血管细节也呈现出清晰的图像。但其不足之处是价格相对昂贵，不具备同时显影脉络膜血管的技术特点，OCT图像的分辨率有待进一步提高，软件功能不够强大等。另外为做到ERG波形稳定，实验过程中应保证小动物眼球与检测设备接触良好。每个实验室应该建立自己的电生理数据标准值，才能分析得到可靠结果。
目前，临床上开展各项影像和功能检查平台已经日趋成熟。然而，动物眼科研究工具的开发略显滞后。小动物眼球极小，且与人眼比较存在屈光系数不同。所以，用于人眼的影像和功能检查仪器难于捕捉到清晰的小鼠眼底血管形态图像以及电生理数据。从最初的视网膜成像显微镜开始，Micron技术不断开发创新的动物眼科研究工具，整合成为成熟的实验室一体化研究平台。本研究采用最新的Micron Ⅳ全功能小动物视网膜活体影像系统，利用明场视网膜成像、荧光素眼底血管造影(FFA)、光相干断层扫描(OCT)以及视网膜电图(ERG)等技术对氧诱导视网膜病变(OIR)、N-甲基-N-亚硝脲(MNU)致视网膜光感受器细胞变性、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜神经节细胞(RGC)急性损伤3种不同的疾病模型小鼠进行检查，分析评价其应用效果。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康雄性C57BL/6J小鼠24只。其中，7日龄6只； 6周龄15只；12月龄3只。清洁级。武汉大学实验动物中心提供。动物饲养和使用遵照实验动物使用的有关规定。
采用抛硬币法将7日龄小鼠随机分为正常对照组和OIR模型组，每组3只小鼠。参照文献[1]的方法建立OIR模型，将小鼠与哺乳母鼠放于自制的密闭氧箱内，控制氧箱内氧气流量在0.5～1.0 L/min，温度维持在25 ℃左右，用测氧仪(CY-12C型，建德市梅城电化分析仪器厂)持续监测氧浓度为(75±2)%。每天观察其生长情况并交替将哺乳母鼠置于正常环境中观察6～8 h后再放回氧箱。小鼠连续吸高浓度氧饲养5 d后，再置于正常氧环境中饲养5 d。正常对照组小鼠置于正常环境温度下饲养至17日龄。
6周龄C57BL/6J小鼠6只，采用抛硬币法随机分为对照组和MNU模型组，每组3只小鼠。新鲜无菌生理盐水配制1%的MNU(美国Sigma公司)，工作液含有0.05%醋酸，避光4 ℃保存。参照文献[2]的方法按体重60 mg/kg的剂量一次腹腔注射建立MNU模型。对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水。
6周龄C57BL/6J小鼠6只，右眼参照文献[3]的方法并适当改进建立NMDA模型(NMDA模型组)。小鼠全身麻醉后，眼表10%碘酊消毒。手术显微镜下，于颞侧角巩膜缘1 mm处用32G针头刺穿，10 μl微量注射器(美国Hamilton公司)注入浓度为10 mmol/L的NMDA(美国Sigma公司) 3 μl，手术结束时结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。左眼(对照组)玻璃体腔注射相同体积的磷酸盐缓冲液。
应用Micron Ⅳ视网膜影像系统(美国Phoenix Research Labs公司)对17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组、NMDA模型组小鼠行眼底彩色照相检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组小鼠行FFA检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，OIR模型组、MNU模型组小鼠行OCT检查；17日龄、6周龄、12月龄小鼠，MNU模型组建模后1、2、3 d和对照组小鼠，NMDA模型组建模后12、24 h和对照组小鼠行ERG检查。
检查时，小鼠搁置于设备配套的小动物台上，全身麻醉后剪去鼠须，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，并在整个操作过程中用羟丙甲纤维素滴眼液湿润角膜，保证屈光间质透明。眼底彩色照相时，小鼠暴露鼠眼并调整镜头方向，直至视网膜目标血管在屏幕清晰可见，在统一的测量参数下拍摄彩色眼底像。OCT检查时，在可视化的明场下，对眼底进行线性水平扫描，10 000 ～ 20 000 A扫描/s，调节接收器增益，经降噪平均后获取OCT图像，横向、纵向分辨率均为2 μm。FFA检查时，按体重0.001 ml/g剂量腹腔注射10%荧光素钠(美国Alcon公司)，1 s内注射完毕。从注射开始计时，摄像机拍摄设置为4帧／s，直至5 min，以后间隔10 min进行1次眼底照相，直至荧光消失。ERG检查时，小鼠暗适应24 h后，于暗室内弱红光照明下进行操作。全身麻醉后，将参考电极和接地电极分别插入到两耳之间和尾根部皮下，用眼科粘弹剂涂抹眼球表面保护角膜和降低干扰，移动金属试验台后微调，使角膜和金属环形记录电极接触，金属试验台与放大器接地线。通过强度为80 Hz的单色光(绿光)刺激闪光模式，间隔10 s进行一次数据采集。同一眼连续测定5次，记录并打印图形。
采用SPSS 13.0统计软件行统计学分析处理。实验数据以均数±标准差(
2 结果
不同年龄段正常小鼠视网膜结构均清晰，视盘位于眼球后部中央，沿视盘发出1只细且直的动脉，伴行8只较粗的视网膜静脉，未见黄斑样结构，无渗出和出血(图 1)。FFA检查结果显示，3～8 s可见视网膜动脉显影，9～20 s后图像清晰，可见眼底1级血管充盈显影；21 s～5 min后可见稀疏的小动脉分支形成的浅层毛细血管网；小静脉汇集成的视网膜静脉；视网膜小血管最小到4级血管均可显像；5 min后背景荧光逐渐变亮，眼底血管走形和轮廓清晰程度能够持续到2 h。显示视网膜血管分布均匀，走行自然。深浅两层血管网清晰可见，深层血管呈多边形网状结构，浅层血管呈放射状分布(图 2)。OCT检查可观察到明显的视网膜分层且结构分明，ERG波形稳定。
OIR 模型组小鼠视网膜血管高度扩张、纡曲，走形僵直，隐约可见暗红色血管网(图 3A)。FFA检查可见后极部无血管灌注区，中周部形态异常、分布紊乱的新生血管丛，荧光渗漏致玻璃体腔混浊(图 3B)。OCT检查可见视网膜前纤维血管组织及纡曲扩张血管后方粗大的阴影暗区(图 3C)。
MNU 模型组小鼠视盘呈蜡黄色萎缩，视网膜颜色灰暗但无明显色素性改变(图 4)。FFA检查可见视网膜血管轻微变细，无明显荧光强度或分布的异常(图 5)。OCT检查可见视网膜厚度正常，结构变化不明显(图 6)。ERG检查结果显示，正常对照组小鼠a、b波潜伏期分别为(28.05±4.08)、(47.35±6.72) ms，最大混合反应a波振幅为(51.88±3.66) μV。MNU模型组小鼠建模后1、2、3 d,a波潜伏期分别为(28.16±3.41)、(29.67±2.60)、(32.90±4.27) ms，b波潜伏期分别为(48.35±4.17)、(47.71±4.35)、(53.02±5.09) ms。a、b波潜伏期变化不明显(图 7)。建模后1、2、3 d，最大混合反应a波振幅分别为(48.87±4.43)、(15.38±4.36)、(13.78±5.52) μV。建模后2、3 d，最大混合反应a波振幅明显下降，下降幅度与建模时间呈正比。建模后2、3 d最大混合反应a波振幅分别与正常组小鼠比较，差异有统计学意义(t=7.650、32.000，P<0.01)。
图1
正常小鼠右眼彩色眼底像。1A～1C.分别为正常对照组，6周龄、12月龄小鼠彩色眼底像。视网膜结构清晰，视盘位于眼球后部中央，沿视盘发出1只细且直的动脉，伴行8只较粗的视网膜静脉，未见黄斑样结构，无渗出和出血 图 2 正常小鼠右眼FFA像。2A～2C.分别正常对照组，6周龄、12个月龄小鼠FFA像。视网膜结构清晰，血管行径正常，荧光充盈均匀，无渗漏 图 3 OIR模型小鼠彩色眼底像、FFA像、水平扫描OCT像。3A.彩色眼底像，视网膜血管高度扩张、纡曲，走形僵直(黑箭)；3B.FFA像，可见形态异常、分布紊乱的新生血管丛(黑箭)，荧光渗漏致玻璃体腔混浊；3C.OCT像，视网膜前纤维血管组织及纡曲扩张血管后方粗大的阴影暗区(白箭) 图 4 MNU模型组小鼠彩色眼底像。视盘呈蜡黄色萎缩 图 5 MNU模型组小鼠FFA像。视网膜血管轻微变细 图 6 MNU模型组小鼠OCT像。视网膜厚度和结构未见改变
图7
MNU模型组小鼠建模后ERG像。7A～7C.分别为建模后1、2、3 d。a、b波潜伏期变化不大；建模后2、3 d最大混合反应a波振幅明显下降(黑箭)
NMDA模型组小鼠视网膜呈苍白色改变，血管痉挛纡曲(图 8)。ERG检查结果显示，NMDA模型组小鼠建模后12、24 h，a波潜伏期分别为(31.84±5.70)、(38.71±6.62) ms，b波潜伏期分别为(44.29±4.62)、(54.86±7.53) ms。a、b波潜伏期变化不明显。正常对照组小鼠最大混合反应b波振幅为(144.40±15.76) μV。NMDA模型组小鼠建模后12、24 h，最大混合反应b波振幅分别为(72.28±7.18)、(65.35±9.18) μV。NMDA模型组小鼠最大混合反应b波振幅明显下降(图 9)，与对照组小鼠最大混合反应b波振幅比较，差异有统计学意义(t=5.123、5.992，P<0.05)。
图8
NMDA模型组小鼠彩色眼底像。8A、8B分别为建模后12、24 h，视网膜呈苍白色改变，血管痉挛纡曲(白箭) 图 9 NMDA模型组小鼠 ERG像。9A、9B分别为建模后12、24 h。最大混合反应b波振幅下降较为明显(黑箭)
3 讨论
眼底疾病种类多样，许多发病机制不明，缺乏有效的治疗方法。因此，建立相应的动物模型对揭示各种眼底疾病的发病机制，探讨疾病的诊断、治疗及预防方法均具有重要意义。本研究应用最新的Micron Ⅳ视网膜影像系统，利用眼底彩色照相、FFA、OCT以及ERG技术对3种常用且具有代表性的小鼠眼科疾病模型进行了无创、实时的分析及评价。探索Micron Ⅳ技术平台在眼科基础研究中的应用价值，以期为今后的研究提供新的思路和手段。
OIR小鼠模型是一种常用的视网膜新生血管模型[1, 4]。既往视网膜新生血管的多少主要通过病理学切片或视网膜铺片中血管造影染色来判断[5]。本研究应用Micron Ⅳ在活体水平上对其进行观察，发现模型组与对照组在视网膜血管形态结构上存在显著差异。整个实验操作过程简单、快捷，图像清晰可靠。证实Micron Ⅳ为眼科研究中动态、持续获取同一动物的活体视网膜影像数据创造了条件。
作为一种烷基化衍生物，MNU可以诱导多种动物视网膜变性[6, 7]，且单次腹腔给药能在1周内造成严重的光感受器细胞损害。导致ERG中起源于视网膜光感受器和色素上皮细胞的a波振幅明显下降，本研究ERG检查结果与既往的文献报道结果一致[8]。且实验结果表明，电生理功能检查比形态学改变更加敏感。进一步证实Micron Ⅳ可实现小动物视网膜功能的精确测量，灵活设定刺激光波长、能量、闪频和脉冲宽度等。
RGC凋亡常见于青光眼和视网膜动脉阻塞等多种视网膜的神经退行性疾病[9]。玻璃体腔注射的NMDA可通过激活视网膜细胞膜上NMDA型谷氨酸受体,导致大量的钙离子内流,随后激活凋亡前信号级联反应，导致神经元的兴奋性毒性损伤[10]。本研究提供了玻璃体腔注射NMDA诱导的急性RGC兴奋毒性损伤在小鼠模型上的建立方法，并进一步利用Micron Ⅳ观察了造模后的结构和功能损伤。结果显示，NMDA模型组小鼠b波波幅出现明显下降。由于b波起源于视网膜内层，与视网膜双极细胞有关。 因此，我们推测可能的原因是双极细胞作为神经节细胞的上游神经元也受到一定的损伤，导致b波振幅的下降。
Micron设备是专为小型实验动物眼球成像而开发的高技术眼科学研究综合平台系统，检查结果被公认为小动物视网膜影像的新标准[11, 12]。其优点在于：(1)上手操作快，无需特殊的实验准备。(2)采用专为小动物设计的视网膜影像撷取系统，更易寻找和观察病变区域。(3)配备小动物操作台可避免人为干扰，结果更稳定。(4)Micron Ⅳ在基本系统平台上可以快速扩展其他功能，此类模式具有重要应用价值。最新一代Micron Ⅳ平台在之前的基础上配备多项扩展功能，覆盖了眼球形态学、功能研究以及激光注入研究等。可选模块包括视网膜显微成像系统、激光注射引导及激光器、高分辨率OCT、裂隙灯成像系统和电生理ERG等。能更加方便清晰地获得小鼠的眼底彩色像和FFA、OCT、ERG图像，为眼科实验动物造模及指标检测提供了极大的便利。此外，Micron Ⅳ可选择多种滤光片或近红外接收系统，提供普通明场、荧光素、伊凡思蓝血管造影以及荧光图像4种成像方式。最先进的的低噪音三芯片CCD相机作为一种高灵敏度感应器，可以捕捉很微弱的荧光，血管细节也呈现出清晰的图像。但其不足之处是价格相对昂贵，不具备同时显影脉络膜血管的技术特点，OCT图像的分辨率有待进一步提高，软件功能不够强大等。另外为做到ERG波形稳定，实验过程中应保证小动物眼球与检测设备接触良好。每个实验室应该建立自己的电生理数据标准值，才能分析得到可靠结果。
