引用本文： 薛敏, 柯屹峰, 任新军, 刘巨平, 范小娥, 李筱荣. 病理性近视患者房水非标记定量蛋白质组学分析. 中华眼底病杂志, 2020, 36(12): 936-942. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200907-00436 复制
病理性近视（PM）通常是指近视屈光度＞6.00 D、眼轴长度＞26.5 mm并伴有后巩膜葡萄肿及黄斑区、脉络膜和视网膜退行性病变的一种可导致低视力甚至致盲的眼病[1]。其确切发病机制尚不明确，现仍处于探索阶段。目前多数研究者认为遗传和环境因素的共同作用可能是其主要的致病原因[2-3]。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，学者们开始尝试利用蛋白质组学技术来探索多种疾病的病理机制[4-5]。非标记蛋白质组学技术是一种不依赖于昂贵同位素标记的新型蛋白质定量技术，该技术利用液相色谱和质谱串联对蛋白质酶解肽段进行分析，比较不同样本中相应肽段的信号强度，通过解析质谱数据对相应的蛋白质进行定量鉴定[6-7]。该技术目前已广泛应用于疾病标志物筛选、疾病发病机制探索、新药开发等生物医学领域。房水是一种重要的眼内液，对维持眼的正常功能有重要意义，其主要作用是为眼组织提供营养并带走代谢废物[8-9]。此外，它还参与了眼组织的免疫反应[10]。房水中的蛋白质成分会在眼部疾病中发生变化。越来越多的研究表明，在房水中发生变化的这些蛋白质与许多眼底疾病的发病机制和（或）预后有关[11-13]。但目前有关PM房水蛋白质组学研究的相关报道较少。为此，本研究利用非标记蛋白质组学技术对PM患者房水进行蛋白质组学研究，筛选房水中的差异表达蛋白，观察PM患者房水蛋白表达谱的改变，以期为深入了解PM的发病机制提供理论依据。
1 对象和方法
1.1 对象
本研究为符合《赫尔辛基宣言》，经天津医科大学眼科医院伦理委员会审批[伦理审查号：2020KY（L）-40]，并取得患者书面知情同意的横断面研究。
2019年1～8月在天津医科大学眼科医院收集32例老年性白内障患者的房水样本进行质谱检测。其中，男性11例，女性21例；年龄58～76岁，平均年龄（68.41±6.09）岁。将合并PM的16例作为PM组，不合并近视的16例作为对照组。PM组纳入标准：（1）眼轴长度≥26.5 mm；（2）伴有等于或大于弥漫性脉络膜萎缩的眼底病变[14]。对照组纳入标准：（1）眼轴长度22.0～24.0 mm；（2）无眼底病变。两组患者均无眼外伤史、PM相关并发症治疗史以及除白内障或近视以外的其他眼部疾病，均未使用全身抗代谢药、免疫抑制剂或皮质类固醇等药物。两组患者性别（χ2=1.247，P=0.264）、年龄（t=－1.384，P=0.176）比较，差异均无统计学意义；眼轴长度比较，差异有统计学意义（t=11.302，P=0.000）（表1）。两组患者晶状体混浊程度分级均为C2N2P2。
表1
两组质谱检测标本基本信息比较
1.2 样本制备
在白内障手术操作之前从手术眼收集100～150 μl前房水。盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉后，0.5%聚维酮碘溶液冲洗结膜囊2次，平衡盐溶液充分冲洗结膜囊。在任何眼内操作之前，于手术显微镜下用1 ml结核菌素注射器在透明角膜缘处采集房水标本，并将其迅速转移到离心管中，－80 ℃冻存备用。
50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室温裂解5 min。冰上超声破碎后，15 ℃条件下16 000×g离心10 min。取上清液，BCA法检测蛋白浓度。取100 μg蛋白加入1 mol/L二硫苏糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入1 mol/L吲哚乙酸4 μl，避光，37 ℃孵育1 h。平衡相对分子质量10×103超滤管1次（50 mmol/L碳酸氢铵400 μl，14 000×g离心10 min），加入100 μg还原烷基化后的样本，15 ℃条件下14 000×g离心20 min，加入50 mmol/L碳酸氢铵400 μl清洗3次，更换收集管，加入50 mmol/L碳酸氢铵50 μl到超滤管中，加入2 μg胰酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液枪混匀超滤管中的样本，4 ℃条件下14 000×g离心20 min，加50 mmol/L碳酸氢铵50 μl冲洗3次，向收集管中加入体积比为1%的甲酸终止酶切，60 ℃真空蒸干。用12 μl 0.1%甲酸重悬样本，Nanodrop分光光度计测量，取等量的肽段进行质谱的检测。
1.3 非标记液相色谱-串联质谱检测
采用EkspertnanoLC 415（美国AB SCIEX公司）液相色谱和TripleTOF 6600（美国AB SCIEX公司）质谱系统进行质谱分析。用上样缓冲液（0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水）将2 μg酶切后的肽段载入到C18填充的离子阱上（100 μm×2 cm，填料规格3 μm，120A）。使用不同梯度的梯度缓冲液（0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水）洗脱离子阱，肽段经过C18填充的柱子后（150 μm×15 cm，填料规格1.9 μm，120A），形成带电的离子喷雾，离子喷雾进入质谱进行检测。梯度缓冲液的有效洗脱梯度为5%～35%，有效时间为91 min，流速为400 nl/min。质谱参数：飞行时间质谱累加时间为0.25 s，质量扫描范围为相对分子质量300～1500，电荷选择+2～+5价离子，质量偏差50 ppm以内，每个循环内最大监测离子数为60，每次检测隔离已检测离子16 s，碎裂能量模式为动态的碎裂模式。产物离子累加时间为0.04 s，采用高灵敏的扫描模式，其余参数与飞行时间质谱参数相同。
1.4 差异表达蛋白鉴定
使用Maxquant软件1.6.3.4版本对质谱采集的原始数据进行数据库的搜索。对搜索后的数据进行统计学分析，筛选可定量蛋白，使用两独立样本t检验计算蛋白表达的P值。筛选P＜0.05且差异倍数大于1.5的差异表达蛋白，去除有0的结果后得到差异表达蛋白的火山图。
1.5 ELISA验证实验
为了进一步验证质谱结果的可靠性，另收集20例合并PM的老年性白内障患者（PM组）和20例不合并近视的单纯性老年性白内障患者（对照组），患者纳入和排除标准均同质谱检测样本。两组患者性别（χ2=0.960，P=0.327）、年龄（t=－1.252，P=0.220）比较，差异均无统计学意义；眼轴长度比较，差异有统计学意义（t=14.306，P=0.000）（表2）。两组患者晶状体混浊程度均为C2N2P2。随机选取5个差异表达蛋白在PM组和对照组中进行ELISA验证。
表2
两组ELISA验证标本基本信息比较
1.6 生物信息学分析
为了进一步探索差异蛋白表达的变化，用基因注释（GO）功能富集对差异表达蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞成分三方面分析。为了探索重要的代谢通路，采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析差异表达蛋白的生物学功能。
1.7 统计学分析
采用SPSS 19.0软件行统计学分析。两组间患者性别比较采用χ2检验，年龄和眼轴长度比较采用两独立样本t检验。分析差异表达蛋白时，对每个可定量蛋白的变化倍数以2为底取对数（Log2FC）作为横坐标，将P值以10为底取负对数［－log10（P值）］作为纵坐标绘制火山图。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 差异表达蛋白分析
PM组、对照组患者房水标本平均蛋白浓度分别为（1 303.06±131.62）ng/L和（734.83±62.54）ng/L。在32份房水标本中共鉴定出583个可定量蛋白质。PM组和对照组之间有101个差异表达蛋白，包括63个上调蛋白和38个下调蛋白。上调明显的蛋白有α-胰蛋白酶抑制剂重链（IITH）1、补体C4B、单核细胞分化抗原CD14、皮质类固醇结合球蛋白（SERPINA6）、IITH2、补体C8B等。下调明显的蛋白有免疫球蛋白kappa变量（IGKV）3-11、IGKV3-15、乳酸脱氢酶、载脂蛋白D、视网膜劈裂蛋白（RS1）、肌营养不良蛋白相关糖蛋白1（DAG1）、溶菌酶、TGFβ诱导蛋白（TGFBI）等（图1）。这101个差异表达蛋白的分类主要是蛋白结合活性调节因子（25.70%）、防御/免疫蛋白（24.80%）、蛋白质修饰酶（11.40%）、代谢物间转换酶（8.70%）、细胞外基质蛋白（7.80%）等（图2）。
图1
差异表达蛋白火山图。IITH1：α-胰蛋白酶抑制剂重链1；SERPINA6：皮质类固醇结合球蛋白；IITH2：α-胰蛋白酶抑制剂重链2；IGKV3-11：免疫球蛋白kappa变量3-11；IGKV3-15：免疫球蛋白kappa变量3-15；LDHA：乳酸脱氢酶；APOD：载脂蛋白D；RS1：视网膜劈裂蛋白；DAG1：肌营养不良蛋白相关糖蛋白1；LYZ：溶菌酶；TGFBI：TGFβ诱导蛋白
图2
不同分类差异表达蛋白的富集度对比
2.2 ELISA验证质谱结果的可靠性
ELISA验证结果显示，随机选取的5个差异表达蛋白在PM组和对照组之间的表达变化趋势均与非标记定量蛋白质组学分析结果一致（图3）。
图3
随机选择的5个差异表达蛋白的ELISA验证结果均与非标记定量蛋白质组学分析结果一致。3A示视网膜劈裂蛋白（RS1）；3B示乳酸脱氢酶（LDHA）；3C示CD14；3D示C4B；3E示溶菌酶（LYZ）。*：P＜0.05，***：P＜0.001
2.3 生物信息学分析
GO功能富集分析结果表明，101个差异表达蛋白与不同的生物学过程、分子功能和细胞组分有关。在生物学过程方面，差异表达蛋白主要富集在补体激活、炎症应答、细胞黏附等方面。在分子功能方面，差异表达蛋白主要富集在补体结合、细胞外基质结合等方面。在细胞组分方面，差异表达蛋白主要富集于细胞外囊泡、细胞外区域等方面（图4）。
图4
差异表达蛋白基因注释分析结果。1：补体激活；2：炎症应答；3：细胞黏附；4：蛋白水解；5：血小板脱颗粒；6：补体激活的调节；7：内肽酶活性的负调节；8：先天免疫反应；9：受体介导细胞摄粒作用；10：免疫应答；11：补体结合；12：细胞外基质结合；13：丝氨酸型内肽酶活性；14：丝氨酸型内肽酶抑制活性；15：肝素结合；16：内肽酶抑制活性；17：受体结合；18：脂质结合；19：蛋白结合；20：钙离子结合；21：细胞外囊泡；22：细胞外区域；23：细胞外间隙；24：血液微粒；25：细胞质膜；26：细胞外基质；27：血小板α颗粒；28：蛋白胞外基质；29：细胞表面；30：基底膜
KEGG通路富集分析结果表明，101个差异表达蛋白富集于7条代谢通路（表3）。其中，26个差异表达蛋白富集于补体和凝血级联通路，10个差异表达蛋白富集于金黄色葡萄球菌感染通路，11个差异表达蛋白富集于系统性红斑狼疮通路，4个差异表达蛋白富集于细胞外基质-受体相互作用通路。
表3
差异表达蛋白KEGG通路富集结果
3 讨论
当PM出现黄斑脉络膜新生血管、脉络膜和视网膜退行性病变时将严重影响患者视力，甚至致盲。积极寻找PM的潜在发病机制，开发有效的治疗靶点，并预测其进展和预后具有重要的临床意义。虽然PM的病理改变主要表现在眼后节，但已有多项研究证据表明房水蛋白质组的变化与眼底疾病密切相关[15-16]。本研究通过对白内障手术中获取到的房水标本进行检测分析，发现32份房水标本中存在581个蛋白质，其中101个蛋白存在差异表达，包括63个上调蛋白和38个下调蛋白。由于PM组和对照组患者的白内障基线病情相同，所以我们认为在房水中发现的差异表达蛋白可以排除白内障病情对结果的影响，仅与PM的发生和发展存在密切联系。通过生物信息学分析，我们发现免疫和炎症的相互作用以及细胞外基质重塑在PM的发病机制中起着主要作用。
KEGG通路富集分析结果表明，富集度最显著的通路为补体和凝血级联，包含26个差异表达蛋白，这与GO功能富集分析结果相一致。这些蛋白质中的大多数具有促炎功能，其中一些在近视患者中呈上调趋势。此外，其他的KEGG富集通路（金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、朊病毒病、百日咳等通路）都与免疫和炎症相互作用有关。GO功能富集分析结果也表明，差异表达蛋白的生物学过程在补体激活和炎症应答反应中富集度高。值得注意的是，属于胰蛋白酶抑制剂家族的ITIH1和ITIH2在炎症中起着重要的作用，在PM患者中表现为上调[17]。此外，与对照组相比，PM组中有更高水平的SERPIN家族的许多炎症蛋白，如SERPIN6和SERPIN1。这和另一项近视的蛋白质组学研究结果相似[18]。另外，已发现补体系统在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性等多种眼部疾病中表达紊乱[19-20]。在本研究中，许多差异表达蛋白，如C4B、CD14、C8B、C8A等，都是参与补体激活和调节的关键免疫蛋白，在PM组中明显上调。从差异表达蛋白的GO功能富集分析结果来看，差异表达蛋白生物学过程中补体激活的明显富集提示PM患者免疫调节活化。由此可见，补体激活与炎症的相互作用在PM的发病机制中起着重要的作用。免疫和炎症相关治疗可能是PM的一种新的临床治疗策略，但是目前尚未得到足够的关注。
巩膜是PM发展过程中的活跃组织。眼轴长短和屈光状态受巩膜细胞外基质组成及其生物力学性能的调节[21]。本研究KEGG通路富集分析中富集了细胞外基质-受体相互作用途径，这与GO功能富集分析结果一致。DAG1是肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的组成成分，参与了细胞骨架与细胞外基质之间附着的主要作用机制，经常在肌-眼-脑综合征中被报道[22]。肌-眼-脑综合征患者常常合并严重的先天性近视，其致病机制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化异常[23]。与对照组相比，PM组TGFBI蛋白明显下降，这和另一项有关近视蛋白质组学的研究结果相一致[18]。TGFBI蛋白是一种分泌型细胞外基质蛋白，已被证实能调节多种细胞的附着[24]。巩膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促进与近视发展相关的巩膜细胞外基质重塑中起着重要作用[25]。TGFBI蛋白可调节人巩膜成纤维细胞在成纤维细胞层界面附着于Ⅰ型胶原，从而调节层状滑移量、巩膜粘弹性和巩膜延长速率[25]。虽然导致PM发生发展的病因尚不清楚，但这些与巩膜生物力学特性改变有关的细胞外基质的生化变化被认为是导致眼轴增长和近视发展的原因。
另外值得关注的结果是，本研究发现了RS1在PM患者房水中明显下调。RS1也称为X连锁青少年视网膜劈裂蛋白，由RS1基因编码，是一种由光感受器细胞和双极细胞分泌的相对分子质量24×103的视网膜特异性蛋白，作为维持视网膜突触结构的细胞黏附蛋白[26]。X连锁先天性视网膜劈裂是由RS1基因突变引起的，其主要机制是其盘状蛋白结构域、亚基组装和内质网加工缺陷[27-28]。鉴于视网膜劈裂是PM的一个常见并发症，据此我们推测RS1可能是PM发生发展的关键蛋白之一，它通过减少细胞黏附和破坏视网膜的突触结构而发挥作用。GO功能富集分析的生物学过程富集结果即细胞黏附也支持这一结果，但RS1蛋白与PM的内在联系还有待进一步研究。
本研究首次通过非标记液相色谱-串联质谱定量蛋白质组学分析发现PM患者房水蛋白质组谱发生了变化，并且这种变化得到了ELISA实验的进一步证实。这些与PM相关的差异表达蛋白主要参与免疫和炎症相互作用以及细胞外基质的重塑。本研究结果提供了PM的发生发展与免疫炎症反应和细胞外基质重塑关系的新证据，指导了PM的致病机制研究和治疗方案探索的方向，但其具体的作用机制仍需要进一步研究。本研究的不足之处在于因临床样本取材的限制，我们无法获得年轻PM患者和正常人的房水进行蛋白组学研究，所以只能尽量控制两组白内障基线病情的一致性，从而减轻白内障对研究结果的干扰。
病理性近视（PM）通常是指近视屈光度＞6.00 D、眼轴长度＞26.5 mm并伴有后巩膜葡萄肿及黄斑区、脉络膜和视网膜退行性病变的一种可导致低视力甚至致盲的眼病[1]。其确切发病机制尚不明确，现仍处于探索阶段。目前多数研究者认为遗传和环境因素的共同作用可能是其主要的致病原因[2-3]。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，学者们开始尝试利用蛋白质组学技术来探索多种疾病的病理机制[4-5]。非标记蛋白质组学技术是一种不依赖于昂贵同位素标记的新型蛋白质定量技术，该技术利用液相色谱和质谱串联对蛋白质酶解肽段进行分析，比较不同样本中相应肽段的信号强度，通过解析质谱数据对相应的蛋白质进行定量鉴定[6-7]。该技术目前已广泛应用于疾病标志物筛选、疾病发病机制探索、新药开发等生物医学领域。房水是一种重要的眼内液，对维持眼的正常功能有重要意义，其主要作用是为眼组织提供营养并带走代谢废物[8-9]。此外，它还参与了眼组织的免疫反应[10]。房水中的蛋白质成分会在眼部疾病中发生变化。越来越多的研究表明，在房水中发生变化的这些蛋白质与许多眼底疾病的发病机制和（或）预后有关[11-13]。但目前有关PM房水蛋白质组学研究的相关报道较少。为此，本研究利用非标记蛋白质组学技术对PM患者房水进行蛋白质组学研究，筛选房水中的差异表达蛋白，观察PM患者房水蛋白表达谱的改变，以期为深入了解PM的发病机制提供理论依据。
1 对象和方法
1.1 对象
本研究为符合《赫尔辛基宣言》，经天津医科大学眼科医院伦理委员会审批[伦理审查号：2020KY（L）-40]，并取得患者书面知情同意的横断面研究。
2019年1～8月在天津医科大学眼科医院收集32例老年性白内障患者的房水样本进行质谱检测。其中，男性11例，女性21例；年龄58～76岁，平均年龄（68.41±6.09）岁。将合并PM的16例作为PM组，不合并近视的16例作为对照组。PM组纳入标准：（1）眼轴长度≥26.5 mm；（2）伴有等于或大于弥漫性脉络膜萎缩的眼底病变[14]。对照组纳入标准：（1）眼轴长度22.0～24.0 mm；（2）无眼底病变。两组患者均无眼外伤史、PM相关并发症治疗史以及除白内障或近视以外的其他眼部疾病，均未使用全身抗代谢药、免疫抑制剂或皮质类固醇等药物。两组患者性别（χ2=1.247，P=0.264）、年龄（t=－1.384，P=0.176）比较，差异均无统计学意义；眼轴长度比较，差异有统计学意义（t=11.302，P=0.000）（表1）。两组患者晶状体混浊程度分级均为C2N2P2。
表1
两组质谱检测标本基本信息比较
1.2 样本制备
在白内障手术操作之前从手术眼收集100～150 μl前房水。盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉后，0.5%聚维酮碘溶液冲洗结膜囊2次，平衡盐溶液充分冲洗结膜囊。在任何眼内操作之前，于手术显微镜下用1 ml结核菌素注射器在透明角膜缘处采集房水标本，并将其迅速转移到离心管中，－80 ℃冻存备用。
50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室温裂解5 min。冰上超声破碎后，15 ℃条件下16 000×g离心10 min。取上清液，BCA法检测蛋白浓度。取100 μg蛋白加入1 mol/L二硫苏糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入1 mol/L吲哚乙酸4 μl，避光，37 ℃孵育1 h。平衡相对分子质量10×103超滤管1次（50 mmol/L碳酸氢铵400 μl，14 000×g离心10 min），加入100 μg还原烷基化后的样本，15 ℃条件下14 000×g离心20 min，加入50 mmol/L碳酸氢铵400 μl清洗3次，更换收集管，加入50 mmol/L碳酸氢铵50 μl到超滤管中，加入2 μg胰酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液枪混匀超滤管中的样本，4 ℃条件下14 000×g离心20 min，加50 mmol/L碳酸氢铵50 μl冲洗3次，向收集管中加入体积比为1%的甲酸终止酶切，60 ℃真空蒸干。用12 μl 0.1%甲酸重悬样本，Nanodrop分光光度计测量，取等量的肽段进行质谱的检测。
1.3 非标记液相色谱-串联质谱检测
采用EkspertnanoLC 415（美国AB SCIEX公司）液相色谱和TripleTOF 6600（美国AB SCIEX公司）质谱系统进行质谱分析。用上样缓冲液（0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水）将2 μg酶切后的肽段载入到C18填充的离子阱上（100 μm×2 cm，填料规格3 μm，120A）。使用不同梯度的梯度缓冲液（0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水）洗脱离子阱，肽段经过C18填充的柱子后（150 μm×15 cm，填料规格1.9 μm，120A），形成带电的离子喷雾，离子喷雾进入质谱进行检测。梯度缓冲液的有效洗脱梯度为5%～35%，有效时间为91 min，流速为400 nl/min。质谱参数：飞行时间质谱累加时间为0.25 s，质量扫描范围为相对分子质量300～1500，电荷选择+2～+5价离子，质量偏差50 ppm以内，每个循环内最大监测离子数为60，每次检测隔离已检测离子16 s，碎裂能量模式为动态的碎裂模式。产物离子累加时间为0.04 s，采用高灵敏的扫描模式，其余参数与飞行时间质谱参数相同。
1.4 差异表达蛋白鉴定
使用Maxquant软件1.6.3.4版本对质谱采集的原始数据进行数据库的搜索。对搜索后的数据进行统计学分析，筛选可定量蛋白，使用两独立样本t检验计算蛋白表达的P值。筛选P＜0.05且差异倍数大于1.5的差异表达蛋白，去除有0的结果后得到差异表达蛋白的火山图。
1.5 ELISA验证实验
为了进一步验证质谱结果的可靠性，另收集20例合并PM的老年性白内障患者（PM组）和20例不合并近视的单纯性老年性白内障患者（对照组），患者纳入和排除标准均同质谱检测样本。两组患者性别（χ2=0.960，P=0.327）、年龄（t=－1.252，P=0.220）比较，差异均无统计学意义；眼轴长度比较，差异有统计学意义（t=14.306，P=0.000）（表2）。两组患者晶状体混浊程度均为C2N2P2。随机选取5个差异表达蛋白在PM组和对照组中进行ELISA验证。
表2
两组ELISA验证标本基本信息比较
1.6 生物信息学分析
为了进一步探索差异蛋白表达的变化，用基因注释（GO）功能富集对差异表达蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞成分三方面分析。为了探索重要的代谢通路，采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析差异表达蛋白的生物学功能。
1.7 统计学分析
采用SPSS 19.0软件行统计学分析。两组间患者性别比较采用χ2检验，年龄和眼轴长度比较采用两独立样本t检验。分析差异表达蛋白时，对每个可定量蛋白的变化倍数以2为底取对数（Log2FC）作为横坐标，将P值以10为底取负对数［－log10（P值）］作为纵坐标绘制火山图。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 差异表达蛋白分析
PM组、对照组患者房水标本平均蛋白浓度分别为（1 303.06±131.62）ng/L和（734.83±62.54）ng/L。在32份房水标本中共鉴定出583个可定量蛋白质。PM组和对照组之间有101个差异表达蛋白，包括63个上调蛋白和38个下调蛋白。上调明显的蛋白有α-胰蛋白酶抑制剂重链（IITH）1、补体C4B、单核细胞分化抗原CD14、皮质类固醇结合球蛋白（SERPINA6）、IITH2、补体C8B等。下调明显的蛋白有免疫球蛋白kappa变量（IGKV）3-11、IGKV3-15、乳酸脱氢酶、载脂蛋白D、视网膜劈裂蛋白（RS1）、肌营养不良蛋白相关糖蛋白1（DAG1）、溶菌酶、TGFβ诱导蛋白（TGFBI）等（图1）。这101个差异表达蛋白的分类主要是蛋白结合活性调节因子（25.70%）、防御/免疫蛋白（24.80%）、蛋白质修饰酶（11.40%）、代谢物间转换酶（8.70%）、细胞外基质蛋白（7.80%）等（图2）。
图1
差异表达蛋白火山图。IITH1：α-胰蛋白酶抑制剂重链1；SERPINA6：皮质类固醇结合球蛋白；IITH2：α-胰蛋白酶抑制剂重链2；IGKV3-11：免疫球蛋白kappa变量3-11；IGKV3-15：免疫球蛋白kappa变量3-15；LDHA：乳酸脱氢酶；APOD：载脂蛋白D；RS1：视网膜劈裂蛋白；DAG1：肌营养不良蛋白相关糖蛋白1；LYZ：溶菌酶；TGFBI：TGFβ诱导蛋白
图2
不同分类差异表达蛋白的富集度对比
2.2 ELISA验证质谱结果的可靠性
ELISA验证结果显示，随机选取的5个差异表达蛋白在PM组和对照组之间的表达变化趋势均与非标记定量蛋白质组学分析结果一致（图3）。
图3
随机选择的5个差异表达蛋白的ELISA验证结果均与非标记定量蛋白质组学分析结果一致。3A示视网膜劈裂蛋白（RS1）；3B示乳酸脱氢酶（LDHA）；3C示CD14；3D示C4B；3E示溶菌酶（LYZ）。*：P＜0.05，***：P＜0.001
2.3 生物信息学分析
GO功能富集分析结果表明，101个差异表达蛋白与不同的生物学过程、分子功能和细胞组分有关。在生物学过程方面，差异表达蛋白主要富集在补体激活、炎症应答、细胞黏附等方面。在分子功能方面，差异表达蛋白主要富集在补体结合、细胞外基质结合等方面。在细胞组分方面，差异表达蛋白主要富集于细胞外囊泡、细胞外区域等方面（图4）。
图4
差异表达蛋白基因注释分析结果。1：补体激活；2：炎症应答；3：细胞黏附；4：蛋白水解；5：血小板脱颗粒；6：补体激活的调节；7：内肽酶活性的负调节；8：先天免疫反应；9：受体介导细胞摄粒作用；10：免疫应答；11：补体结合；12：细胞外基质结合；13：丝氨酸型内肽酶活性；14：丝氨酸型内肽酶抑制活性；15：肝素结合；16：内肽酶抑制活性；17：受体结合；18：脂质结合；19：蛋白结合；20：钙离子结合；21：细胞外囊泡；22：细胞外区域；23：细胞外间隙；24：血液微粒；25：细胞质膜；26：细胞外基质；27：血小板α颗粒；28：蛋白胞外基质；29：细胞表面；30：基底膜
KEGG通路富集分析结果表明，101个差异表达蛋白富集于7条代谢通路（表3）。其中，26个差异表达蛋白富集于补体和凝血级联通路，10个差异表达蛋白富集于金黄色葡萄球菌感染通路，11个差异表达蛋白富集于系统性红斑狼疮通路，4个差异表达蛋白富集于细胞外基质-受体相互作用通路。
表3
差异表达蛋白KEGG通路富集结果
3 讨论
当PM出现黄斑脉络膜新生血管、脉络膜和视网膜退行性病变时将严重影响患者视力，甚至致盲。积极寻找PM的潜在发病机制，开发有效的治疗靶点，并预测其进展和预后具有重要的临床意义。虽然PM的病理改变主要表现在眼后节，但已有多项研究证据表明房水蛋白质组的变化与眼底疾病密切相关[15-16]。本研究通过对白内障手术中获取到的房水标本进行检测分析，发现32份房水标本中存在581个蛋白质，其中101个蛋白存在差异表达，包括63个上调蛋白和38个下调蛋白。由于PM组和对照组患者的白内障基线病情相同，所以我们认为在房水中发现的差异表达蛋白可以排除白内障病情对结果的影响，仅与PM的发生和发展存在密切联系。通过生物信息学分析，我们发现免疫和炎症的相互作用以及细胞外基质重塑在PM的发病机制中起着主要作用。
KEGG通路富集分析结果表明，富集度最显著的通路为补体和凝血级联，包含26个差异表达蛋白，这与GO功能富集分析结果相一致。这些蛋白质中的大多数具有促炎功能，其中一些在近视患者中呈上调趋势。此外，其他的KEGG富集通路（金黄色葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮、朊病毒病、百日咳等通路）都与免疫和炎症相互作用有关。GO功能富集分析结果也表明，差异表达蛋白的生物学过程在补体激活和炎症应答反应中富集度高。值得注意的是，属于胰蛋白酶抑制剂家族的ITIH1和ITIH2在炎症中起着重要的作用，在PM患者中表现为上调[17]。此外，与对照组相比，PM组中有更高水平的SERPIN家族的许多炎症蛋白，如SERPIN6和SERPIN1。这和另一项近视的蛋白质组学研究结果相似[18]。另外，已发现补体系统在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变和老年性黄斑变性等多种眼部疾病中表达紊乱[19-20]。在本研究中，许多差异表达蛋白，如C4B、CD14、C8B、C8A等，都是参与补体激活和调节的关键免疫蛋白，在PM组中明显上调。从差异表达蛋白的GO功能富集分析结果来看，差异表达蛋白生物学过程中补体激活的明显富集提示PM患者免疫调节活化。由此可见，补体激活与炎症的相互作用在PM的发病机制中起着重要的作用。免疫和炎症相关治疗可能是PM的一种新的临床治疗策略，但是目前尚未得到足够的关注。
巩膜是PM发展过程中的活跃组织。眼轴长短和屈光状态受巩膜细胞外基质组成及其生物力学性能的调节[21]。本研究KEGG通路富集分析中富集了细胞外基质-受体相互作用途径，这与GO功能富集分析结果一致。DAG1是肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的组成成分，参与了细胞骨架与细胞外基质之间附着的主要作用机制，经常在肌-眼-脑综合征中被报道[22]。肌-眼-脑综合征患者常常合并严重的先天性近视，其致病机制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化异常[23]。与对照组相比，PM组TGFBI蛋白明显下降，这和另一项有关近视蛋白质组学的研究结果相一致[18]。TGFBI蛋白是一种分泌型细胞外基质蛋白，已被证实能调节多种细胞的附着[24]。巩膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促进与近视发展相关的巩膜细胞外基质重塑中起着重要作用[25]。TGFBI蛋白可调节人巩膜成纤维细胞在成纤维细胞层界面附着于Ⅰ型胶原，从而调节层状滑移量、巩膜粘弹性和巩膜延长速率[25]。虽然导致PM发生发展的病因尚不清楚，但这些与巩膜生物力学特性改变有关的细胞外基质的生化变化被认为是导致眼轴增长和近视发展的原因。
另外值得关注的结果是，本研究发现了RS1在PM患者房水中明显下调。RS1也称为X连锁青少年视网膜劈裂蛋白，由RS1基因编码，是一种由光感受器细胞和双极细胞分泌的相对分子质量24×103的视网膜特异性蛋白，作为维持视网膜突触结构的细胞黏附蛋白[26]。X连锁先天性视网膜劈裂是由RS1基因突变引起的，其主要机制是其盘状蛋白结构域、亚基组装和内质网加工缺陷[27-28]。鉴于视网膜劈裂是PM的一个常见并发症，据此我们推测RS1可能是PM发生发展的关键蛋白之一，它通过减少细胞黏附和破坏视网膜的突触结构而发挥作用。GO功能富集分析的生物学过程富集结果即细胞黏附也支持这一结果，但RS1蛋白与PM的内在联系还有待进一步研究。
本研究首次通过非标记液相色谱-串联质谱定量蛋白质组学分析发现PM患者房水蛋白质组谱发生了变化，并且这种变化得到了ELISA实验的进一步证实。这些与PM相关的差异表达蛋白主要参与免疫和炎症相互作用以及细胞外基质的重塑。本研究结果提供了PM的发生发展与免疫炎症反应和细胞外基质重塑关系的新证据，指导了PM的致病机制研究和治疗方案探索的方向，但其具体的作用机制仍需要进一步研究。本研究的不足之处在于因临床样本取材的限制，我们无法获得年轻PM患者和正常人的房水进行蛋白组学研究，所以只能尽量控制两组白内障基线病情的一致性，从而减轻白内障对研究结果的干扰。
