引用本文： 杨宋阳, 张明亮, 胡岚岚, 王礼明, 张晓敏, 李筱荣. 单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态. 中华眼底病杂志, 2021, 37(2): 138-144. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200608-00265 复制
新生血管（NV）在新生血管性老年性黄斑变性（AMD）、增生型糖尿病视网膜病变（PDR）等多种不可逆视力损害性眼病中扮演重要角色[1]。NV是一个复杂而协调的过程，需要大量受体的有序激活，其中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体发挥关键作用。VEGF受体2（VEGFR2）磷酸化激活后主要诱导血管内皮细胞的增生、迁移和存活等，是血管生成主要的关键限速步骤[2]。其细胞外结构域（ECD）与VEGF结合后由单体转变为二聚体，形成的二聚体复合物介导细胞内酪氨酸激酶结构域活化，该结构变化对于受体磷酸化至关重要[3-5]。深入了解细胞膜表面VEGFR2的聚集状态可以加深人们对VEGF信号通路的理解。然而，有关无配体状态下VEGFR2是否存在一定比例的二聚体形式尚存争议。既往研究多基于体外生物化学方法的测定，无法展示单个细胞上受体分子的聚集状态。为探讨单个细胞膜上VEGFR2的聚集状态，本研究使用单分子成像技术对猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）转染标记有绿色荧光蛋白（GFP）的VEGFR2重组质粒，采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察单个VEGFR2分子在细胞膜上的聚集状态。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
RF/6A由天津医科大学眼科医院自行保存[6]。胰蛋白酶、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS）、最低基础培养基（MEM）、非必需氨基酸、谷氨酰胺（GlutaMAX）（美国Gibco公司）；6孔板及T75细胞培养瓶（美国Corning公司）；共聚焦培养皿（美国Cellvis公司）；抗VEGFR2抗体（编号2479）、抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（编号4970）（美国CST公司）；化学发光液、脂质体3000（Lipofectamine3000）（美国Thermo Fisher公司）；细胞总蛋白提取试剂盒（Minute，美国Invent公司）；细胞RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR荧光染料（美国EZBioscience公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料（DAPI，美国Thermo Fisher公司）；共聚焦显微镜（德国蔡司公司）；TIRFM（日本奥林巴斯公司，中国科学院化学研究所方晓红研究员课题组搭建）。
1.2 细胞培养、脂质体转染及实验分组
使用含10%胎牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸和1% GlutaMAX的MEM完全培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，取第3代细胞用于实验。由生工生物工程股份有限公司构建带有GFP标记的VEGFR2质粒，将合成的质粒转入大肠杆菌感受态细胞，倒置培养后从固体培养皿上挑取单个菌落接种于含有卡那霉素的液体培养基中，摇床中37 ℃、220 r/min震荡14 h。使用质粒小提试剂盒提取VEGFR2质粒测定浓度；酶切后进行电泳实验以检测目的条带并测序，经测序验证正确的阳性克隆，进行质粒大提。
将RF/6A分为空白对照组、质粒转染组（VEGFR2-GFP重组质粒转染）。质粒转染组将细胞接种于6孔板中，当细胞汇合度达到70%～80%时更换无血清培养基饥饿过夜，次日使用125 μl无血清培养液稀释3 μl Lipofectamine3000转染试剂，与质粒DNA混合后室温孵育10 min再加入细胞中，6 h后更换为完全培养基继续培养6 h，即细胞总培养12 h后进行后续实验。空白对照组正常培养，接种12 h后进行后续试验。
1.3 共聚焦显微镜观察
将细胞接种至共聚焦培养皿中，转染12 h后使用甲醇固定，PBS洗去残余甲醇后加入DAPI染色10 min，最后加入PBS保持细胞湿润。将培养皿放入共聚焦显微镜进行成像，观察质粒转染组GFP的表达情况。
1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）检测
采用qPCR检测VEGFR2、GFP和β-actin的mRNA表达。使用细胞RNA提取试剂盒提取总RNA，经分光光度计检测浓度，以吸光度［A，旧称光密度（OD）］A260/A280比值介于1.8～2.0之间认为RNA提取质量良好，使用逆转录试剂盒逆转录后得到的cDNA产物用于PCR反应。根据美国国家生物技术信息中心数据库中的VEGFR2、GFP、β-actin设计引物序列（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。扩增反应中将4 μl模板cDNA、正向反向引物各0.4 μl、5.2 μl ddH2O和10 μl SYBR荧光染料依次加入96孔板。每组3个复孔，实验重复3次。放入qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct），依照公式2-ΔΔCt法进行数据分析。
表1
基因扩增测序引物
采用Western blot检测VEGFR2、β-actin蛋白表达。质粒转染细胞后12 h收集细胞进行总蛋白提取，调整蛋白浓度等量等体积上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。湿转后5%脱脂奶粉室温封闭1 h；4 ℃一抗孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBST）洗膜3次，每次10 min；辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后加入化学发光液曝光并拍照。实验共重复3次。
1.5 单分子成像及数据分析
细胞经甲醇固定后釆用TIRFM进行单分子成像。研究中所涉及到的图像分析处理均采用美国国立卫生研究院（NIH）Image J软件完成（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。参照文献[7-8]的方法分析细胞膜上单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和光漂白步数。
釆集图像时，电子倍增电荷耦合器件照相机增益设为300。激发波长为488 nm，采集速度为10 Hz，每个影像持续采集400帧。数据分析，使用NIH Image J软件中的滚雪球法（rolling ball method）从固定细胞中获取的影片中减去背景荧光，然后将前五帧图片叠加后进行平均，使用Matlab程序（由中国科学院化学研究所袁景和博士编写）采用高斯拟合的方法寻找所有高于阈值的点。经过算法筛选后，保留符合要求的点，并在图像中用绿色圆圈圈定。参照文献[8]的方法，通过统计融合到蛋白质上GFP的漂白步骤确定膜结合蛋白的亚基数和化学计量学状态。漂白曲线记录筛选出单分子点每一帧的荧光强度值，用作漂白步数统计分析，激光照射后单个GFP荧光分子的荧光强度随时间的变化存在台阶状突然下降现象，是典型的一步光漂白特征，表明目的受体为单体；若复合物具有两个荧光分子，可以观测到它们在不同时间相继淬灭，荧光强度出现两个台阶状下降，提示复合物为二聚体，部分漂白台阶无法判断或者漂白行为异常的点给予舍弃；一段时间后，全部荧光分子都被漂白，使用算法可以自动确定VEGFR2-GFP分子的光漂白步骤并进行统计分析，即可推断出漂白荧光分子的数目，得到细胞膜目标蛋白的亚基构成比例。荧光强度分析使用多个细胞中找到的单分子荧光点的第一帧荧光强度汇总为荧光强度分布曲线，通过统计细胞膜上荧光分子的荧光强度分布，进行多峰高斯函数拟合判断不同组分的比例[9]。上述分析方法同时应用，相互验证。
1.6 统计学分析
采用GraphPad Prism8软件进行统计分析。数据结果均符合正态分布，以均数±标准差（
）表示。两组数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
共聚焦显微镜观察发现，RF/6A细胞在VEGFR2-GFP重组质粒转染12 h后可以检测到GFP绿色荧光表达，细胞核呈蓝色荧光表达（图1）。
图1
血管内皮生长因子受体2-绿色荧光蛋白（GFP）重组质粒转染猴视网膜血管内皮细胞12 h后共聚焦显微镜像。1A示GFP绿色荧光 GFP 标尺：10 μm；1B示细胞核呈蓝色荧光 苯基吲哚 标尺：10 μm；1C示1A和1B合成像 GFP+苯基吲哚 标尺：10 μm
qPCR检测结果显示，空白对照组、质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA相对表达量分别为1.000±0.975、11 532.854±1 777.394和1.000±0.067、5 988.186±840.707。两组细胞中VEGFR2、GFP mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（t=11.240、12.330，P＜0.001、＜0.001）（图2）。
图2
质粒转染组和空白对照组猴视网膜血管内皮细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA相对表达量比较。***P＜0.001
Western blot检测结果显示，质粒转染组VEGFR2蛋白表达较空白对照组明显升高, 差异有统计学意义（t=8.346，P＜0.01）（图3）。
图3
质粒转染组和空白对照组猴视网膜血管内皮细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、绿色荧光蛋白（GFP）蛋白表达比较。3A示蛋白免疫印迹电泳像；3B示VEGFR2、GFP蛋白表达比较统计图。**P＜0.01
单分子成像结果显示，无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2-GFP的荧光强度分布为双峰，其中第二个峰的强度（62.98）大约是第一个峰（33.15）的2倍，即它们分别是二聚体和单体，其比例分别为86.0%、14.0%。通过计数GFP荧光漂白步数，静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%（图4）。
图4
单分子成像及数据分析图。4A、4B示全内反射荧光显微镜（TIRFM）像（标尺：10 μm）。4A展示了TIRFM观察到的细胞膜，4B中白箭指示的绿色圆圈（5像素×5像素）为标注的衍射受限点，表示程序实际检测到的单个血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）-绿色荧光蛋白（GFP）分子，用以进行光漂白步数和荧光强度分析。4C、4D示光漂白步数分析。4C为一步漂白，黑箭提示一个台阶状下降，表示受体为单体；4D为两步漂白，黑箭提示两个台阶状下降，表示受体为二聚体。4E示荧光强度分析。统计衍射极限荧光强度的分布，曲线显示了高斯函数的拟合，两个峰值分别代表了VEGFR2-GFP单体和二聚体的强度，高斯拟合的相关系数为0.97，箭头指示拟合曲线的峰值位置，括号中的数字分别是单体和二聚体所占比例。4F示光漂白步数统计。显示VEGFR2-GFP单体、二聚体、三聚体、四聚体所占比例
3 讨论
NV是多种致盲性眼病的共同特征。根据NV发生的部位不同，分为视网膜NV和视网膜下NV，前者主要包含PDR、早产儿视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞[10-12]；后者可见于AMD[13]。NV病理过程通常包含两个阶段，首先是各种因素导致的现有视网膜血管闭塞，出现组织相对缺氧，继而大量产生和释放缺氧诱导因子，如VEGF、血管生成素2以及促红细胞生成素等，最终诱导NV生成。其中，VEGF信号通路是一个关键限速步骤[14]。VEGFR2属于受体酪氨酸激酶（RTK），是内皮细胞中传递VEGF信号的主要受体，也是促有丝分裂、血管生成和增强通透性的主要介质[15-16]。同多数RTK一样，VEGFR2由ECD、跨膜结构域和细胞内结构域组成。
对于VEGFR2跨膜信号转导的结构模型，广泛接受的是“经典模型”。采用负染色单粒子电子显微镜和溶液中小角度X射线散射技术可以发现，未与配体结合状态下，VEGFR2的ECD呈单体状态[5, 17]。全长VEGFR2的免疫共沉淀实验发现，除非以极高的水平表达受体，受体在无配体状态下不会产生二聚行为，配体同受体结合后，二者的催化结构域紧密靠近形成二聚体从而诱导产生交叉磷酸化[4, 18]。第二种理论则认为受体可以在无配体的情况下预先形成二聚体，受体本身序列具有一定的编码倾向性，可以通过侧面相互作用形成二聚体。因此，受体持续处于单体-二聚体动态平衡状态。既往研究使用福斯特能量共振转移（FRET）技术观察发现，在无配体状态下，30%～60%的VEGFR2受体呈二聚体状态[19]。VEGFR2和成纤维细胞生长因子（FGF）同属于RTK，有学者在观察FGF时提出RTK激活的“经典模型”与“预先形成的二聚体模型”之间的不同可能并非根本差异，更为关键的特点在于非配体结合状态下二聚体比例的大小，并由此提出一种通用的RTK激活模型，这一模型包括单体、结合配体的二聚体和作为中间体的非配体二聚体[20]。
单分子成像技术由TIRFM成像，通过减少激发和检测体积，照明区域被限定在细胞表面百纳米级厚度的薄层范围内，有效控制了激发体积，具有其他光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度，而且能够发现传统手段难以检测到的分子在空间和时间上的变化[7]。近年来该技术已广泛用于膜蛋白复合物亚基组成的相关研究[21]。本研究使用单分子成像技术探索单个细胞上的单个VEGFR2受体的聚集状态[22]，结果显示内皮细胞膜表面的VEGFR2在无配体情况下存在14.0%的二聚体以及86.0%的单体。这和Sarabipour等[19]使用FRET技术的研究结论是一致的，同时也验证了最近提出的通用模型同样适用于VEGFR2。需要注意的是，FRET基于细胞膜表面受体的平均测量通常需要有高水平受体表达，这可能是与本研究的观测结果在数值上存在一定差异的原因。
预先形成的无配体二聚体与VEGF的亲和力相较于单体强约100倍，可在配体出现时快速激活[23]。VEGF与无配体二聚体结合后可以稳定复合物结构，减少受体的移动性[24]。抗VEGF药物目前成为治疗新生血管性AMD等疾病的一线方案，但是不同的患者却对其表现出不同的反应性。有些患者的脉络膜新生血管在初始治疗后即稳定，而有些患者的脉络膜新生血管却在持续性的每月注药达12次后仍有活动[25]。有研究发现，雷珠单抗和阿柏西普还展现出上限效应，即不能单纯通过增大药物剂量获得更好的视力收益[26]。目前应用的单克隆抗体和融合蛋白类药物均通过结合游离的VEGF阻断下游信号通路的激活，抗VEGF药物注射后眼内仍存在较低浓度的VEGF[27]。本研究结果显示，生理状态下内皮细胞表面存在约14.0%的无配体二聚体，配体可以和亲和力更高的二聚体结合而激活增生迁移信号，从而促进新生血管的生成。这一发现提示在临床治疗中需要转换思路，使用VEGFR2的抑制剂或可为目前的临床治疗提供补充。雷莫芦单抗（IMC-1211B，ramucirumab）是人源性IgG抗体，临床前模型显示这种单克隆抗体与VEGFR2-ECD的亲和力更高，通过阻断受体避免多种VEGF亚型发挥激活作用[28]。目前该药物已经获批用于转移性非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的治疗，已有应用于眼科治疗的早期安全性评估报道[29]。
抗VEGF药物在眼部的应用为众多眼底新生血管性疾病的患者保留了有用视力，但是这类药物仍有需要改善的地方。完善VEGF与VEGFR2结合激活的生物学结构模型，有助于人们深入了解VEGF信号通路，为进一步探索阻断VEGFR2发生二聚体化提供新的理论依据，为最终抑制NV的形成提供新的思路。
新生血管（NV）在新生血管性老年性黄斑变性（AMD）、增生型糖尿病视网膜病变（PDR）等多种不可逆视力损害性眼病中扮演重要角色[1]。NV是一个复杂而协调的过程，需要大量受体的有序激活，其中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体发挥关键作用。VEGF受体2（VEGFR2）磷酸化激活后主要诱导血管内皮细胞的增生、迁移和存活等，是血管生成主要的关键限速步骤[2]。其细胞外结构域（ECD）与VEGF结合后由单体转变为二聚体，形成的二聚体复合物介导细胞内酪氨酸激酶结构域活化，该结构变化对于受体磷酸化至关重要[3-5]。深入了解细胞膜表面VEGFR2的聚集状态可以加深人们对VEGF信号通路的理解。然而，有关无配体状态下VEGFR2是否存在一定比例的二聚体形式尚存争议。既往研究多基于体外生物化学方法的测定，无法展示单个细胞上受体分子的聚集状态。为探讨单个细胞膜上VEGFR2的聚集状态，本研究使用单分子成像技术对猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）转染标记有绿色荧光蛋白（GFP）的VEGFR2重组质粒，采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察单个VEGFR2分子在细胞膜上的聚集状态。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
RF/6A由天津医科大学眼科医院自行保存[6]。胰蛋白酶、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS）、最低基础培养基（MEM）、非必需氨基酸、谷氨酰胺（GlutaMAX）（美国Gibco公司）；6孔板及T75细胞培养瓶（美国Corning公司）；共聚焦培养皿（美国Cellvis公司）；抗VEGFR2抗体（编号2479）、抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（编号4970）（美国CST公司）；化学发光液、脂质体3000（Lipofectamine3000）（美国Thermo Fisher公司）；细胞总蛋白提取试剂盒（Minute，美国Invent公司）；细胞RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR荧光染料（美国EZBioscience公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料（DAPI，美国Thermo Fisher公司）；共聚焦显微镜（德国蔡司公司）；TIRFM（日本奥林巴斯公司，中国科学院化学研究所方晓红研究员课题组搭建）。
1.2 细胞培养、脂质体转染及实验分组
使用含10%胎牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸和1% GlutaMAX的MEM完全培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，取第3代细胞用于实验。由生工生物工程股份有限公司构建带有GFP标记的VEGFR2质粒，将合成的质粒转入大肠杆菌感受态细胞，倒置培养后从固体培养皿上挑取单个菌落接种于含有卡那霉素的液体培养基中，摇床中37 ℃、220 r/min震荡14 h。使用质粒小提试剂盒提取VEGFR2质粒测定浓度；酶切后进行电泳实验以检测目的条带并测序，经测序验证正确的阳性克隆，进行质粒大提。
将RF/6A分为空白对照组、质粒转染组（VEGFR2-GFP重组质粒转染）。质粒转染组将细胞接种于6孔板中，当细胞汇合度达到70%～80%时更换无血清培养基饥饿过夜，次日使用125 μl无血清培养液稀释3 μl Lipofectamine3000转染试剂，与质粒DNA混合后室温孵育10 min再加入细胞中，6 h后更换为完全培养基继续培养6 h，即细胞总培养12 h后进行后续实验。空白对照组正常培养，接种12 h后进行后续试验。
1.3 共聚焦显微镜观察
将细胞接种至共聚焦培养皿中，转染12 h后使用甲醇固定，PBS洗去残余甲醇后加入DAPI染色10 min，最后加入PBS保持细胞湿润。将培养皿放入共聚焦显微镜进行成像，观察质粒转染组GFP的表达情况。
1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）检测
采用qPCR检测VEGFR2、GFP和β-actin的mRNA表达。使用细胞RNA提取试剂盒提取总RNA，经分光光度计检测浓度，以吸光度［A，旧称光密度（OD）］A260/A280比值介于1.8～2.0之间认为RNA提取质量良好，使用逆转录试剂盒逆转录后得到的cDNA产物用于PCR反应。根据美国国家生物技术信息中心数据库中的VEGFR2、GFP、β-actin设计引物序列（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。扩增反应中将4 μl模板cDNA、正向反向引物各0.4 μl、5.2 μl ddH2O和10 μl SYBR荧光染料依次加入96孔板。每组3个复孔，实验重复3次。放入qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct），依照公式2-ΔΔCt法进行数据分析。
表1
基因扩增测序引物
采用Western blot检测VEGFR2、β-actin蛋白表达。质粒转染细胞后12 h收集细胞进行总蛋白提取，调整蛋白浓度等量等体积上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。湿转后5%脱脂奶粉室温封闭1 h；4 ℃一抗孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBST）洗膜3次，每次10 min；辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后加入化学发光液曝光并拍照。实验共重复3次。
1.5 单分子成像及数据分析
细胞经甲醇固定后釆用TIRFM进行单分子成像。研究中所涉及到的图像分析处理均采用美国国立卫生研究院（NIH）Image J软件完成（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。参照文献[7-8]的方法分析细胞膜上单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和光漂白步数。
釆集图像时，电子倍增电荷耦合器件照相机增益设为300。激发波长为488 nm，采集速度为10 Hz，每个影像持续采集400帧。数据分析，使用NIH Image J软件中的滚雪球法（rolling ball method）从固定细胞中获取的影片中减去背景荧光，然后将前五帧图片叠加后进行平均，使用Matlab程序（由中国科学院化学研究所袁景和博士编写）采用高斯拟合的方法寻找所有高于阈值的点。经过算法筛选后，保留符合要求的点，并在图像中用绿色圆圈圈定。参照文献[8]的方法，通过统计融合到蛋白质上GFP的漂白步骤确定膜结合蛋白的亚基数和化学计量学状态。漂白曲线记录筛选出单分子点每一帧的荧光强度值，用作漂白步数统计分析，激光照射后单个GFP荧光分子的荧光强度随时间的变化存在台阶状突然下降现象，是典型的一步光漂白特征，表明目的受体为单体；若复合物具有两个荧光分子，可以观测到它们在不同时间相继淬灭，荧光强度出现两个台阶状下降，提示复合物为二聚体，部分漂白台阶无法判断或者漂白行为异常的点给予舍弃；一段时间后，全部荧光分子都被漂白，使用算法可以自动确定VEGFR2-GFP分子的光漂白步骤并进行统计分析，即可推断出漂白荧光分子的数目，得到细胞膜目标蛋白的亚基构成比例。荧光强度分析使用多个细胞中找到的单分子荧光点的第一帧荧光强度汇总为荧光强度分布曲线，通过统计细胞膜上荧光分子的荧光强度分布，进行多峰高斯函数拟合判断不同组分的比例[9]。上述分析方法同时应用，相互验证。
1.6 统计学分析
采用GraphPad Prism8软件进行统计分析。数据结果均符合正态分布，以均数±标准差（）表示。两组数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
共聚焦显微镜观察发现，RF/6A细胞在VEGFR2-GFP重组质粒转染12 h后可以检测到GFP绿色荧光表达，细胞核呈蓝色荧光表达（图1）。
图1
血管内皮生长因子受体2-绿色荧光蛋白（GFP）重组质粒转染猴视网膜血管内皮细胞12 h后共聚焦显微镜像。1A示GFP绿色荧光 GFP 标尺：10 μm；1B示细胞核呈蓝色荧光 苯基吲哚 标尺：10 μm；1C示1A和1B合成像 GFP+苯基吲哚 标尺：10 μm
qPCR检测结果显示，空白对照组、质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA相对表达量分别为1.000±0.975、11 532.854±1 777.394和1.000±0.067、5 988.186±840.707。两组细胞中VEGFR2、GFP mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（t=11.240、12.330，P＜0.001、＜0.001）（图2）。
图2
质粒转染组和空白对照组猴视网膜血管内皮细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、绿色荧光蛋白（GFP）mRNA相对表达量比较。***P＜0.001
Western blot检测结果显示，质粒转染组VEGFR2蛋白表达较空白对照组明显升高, 差异有统计学意义（t=8.346，P＜0.01）（图3）。
图3
质粒转染组和空白对照组猴视网膜血管内皮细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、绿色荧光蛋白（GFP）蛋白表达比较。3A示蛋白免疫印迹电泳像；3B示VEGFR2、GFP蛋白表达比较统计图。**P＜0.01
单分子成像结果显示，无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2-GFP的荧光强度分布为双峰，其中第二个峰的强度（62.98）大约是第一个峰（33.15）的2倍，即它们分别是二聚体和单体，其比例分别为86.0%、14.0%。通过计数GFP荧光漂白步数，静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%（图4）。
图4
单分子成像及数据分析图。4A、4B示全内反射荧光显微镜（TIRFM）像（标尺：10 μm）。4A展示了TIRFM观察到的细胞膜，4B中白箭指示的绿色圆圈（5像素×5像素）为标注的衍射受限点，表示程序实际检测到的单个血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）-绿色荧光蛋白（GFP）分子，用以进行光漂白步数和荧光强度分析。4C、4D示光漂白步数分析。4C为一步漂白，黑箭提示一个台阶状下降，表示受体为单体；4D为两步漂白，黑箭提示两个台阶状下降，表示受体为二聚体。4E示荧光强度分析。统计衍射极限荧光强度的分布，曲线显示了高斯函数的拟合，两个峰值分别代表了VEGFR2-GFP单体和二聚体的强度，高斯拟合的相关系数为0.97，箭头指示拟合曲线的峰值位置，括号中的数字分别是单体和二聚体所占比例。4F示光漂白步数统计。显示VEGFR2-GFP单体、二聚体、三聚体、四聚体所占比例
3 讨论
NV是多种致盲性眼病的共同特征。根据NV发生的部位不同，分为视网膜NV和视网膜下NV，前者主要包含PDR、早产儿视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞[10-12]；后者可见于AMD[13]。NV病理过程通常包含两个阶段，首先是各种因素导致的现有视网膜血管闭塞，出现组织相对缺氧，继而大量产生和释放缺氧诱导因子，如VEGF、血管生成素2以及促红细胞生成素等，最终诱导NV生成。其中，VEGF信号通路是一个关键限速步骤[14]。VEGFR2属于受体酪氨酸激酶（RTK），是内皮细胞中传递VEGF信号的主要受体，也是促有丝分裂、血管生成和增强通透性的主要介质[15-16]。同多数RTK一样，VEGFR2由ECD、跨膜结构域和细胞内结构域组成。
对于VEGFR2跨膜信号转导的结构模型，广泛接受的是“经典模型”。采用负染色单粒子电子显微镜和溶液中小角度X射线散射技术可以发现，未与配体结合状态下，VEGFR2的ECD呈单体状态[5, 17]。全长VEGFR2的免疫共沉淀实验发现，除非以极高的水平表达受体，受体在无配体状态下不会产生二聚行为，配体同受体结合后，二者的催化结构域紧密靠近形成二聚体从而诱导产生交叉磷酸化[4, 18]。第二种理论则认为受体可以在无配体的情况下预先形成二聚体，受体本身序列具有一定的编码倾向性，可以通过侧面相互作用形成二聚体。因此，受体持续处于单体-二聚体动态平衡状态。既往研究使用福斯特能量共振转移（FRET）技术观察发现，在无配体状态下，30%～60%的VEGFR2受体呈二聚体状态[19]。VEGFR2和成纤维细胞生长因子（FGF）同属于RTK，有学者在观察FGF时提出RTK激活的“经典模型”与“预先形成的二聚体模型”之间的不同可能并非根本差异，更为关键的特点在于非配体结合状态下二聚体比例的大小，并由此提出一种通用的RTK激活模型，这一模型包括单体、结合配体的二聚体和作为中间体的非配体二聚体[20]。
单分子成像技术由TIRFM成像，通过减少激发和检测体积，照明区域被限定在细胞表面百纳米级厚度的薄层范围内，有效控制了激发体积，具有其他光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度，而且能够发现传统手段难以检测到的分子在空间和时间上的变化[7]。近年来该技术已广泛用于膜蛋白复合物亚基组成的相关研究[21]。本研究使用单分子成像技术探索单个细胞上的单个VEGFR2受体的聚集状态[22]，结果显示内皮细胞膜表面的VEGFR2在无配体情况下存在14.0%的二聚体以及86.0%的单体。这和Sarabipour等[19]使用FRET技术的研究结论是一致的，同时也验证了最近提出的通用模型同样适用于VEGFR2。需要注意的是，FRET基于细胞膜表面受体的平均测量通常需要有高水平受体表达，这可能是与本研究的观测结果在数值上存在一定差异的原因。
预先形成的无配体二聚体与VEGF的亲和力相较于单体强约100倍，可在配体出现时快速激活[23]。VEGF与无配体二聚体结合后可以稳定复合物结构，减少受体的移动性[24]。抗VEGF药物目前成为治疗新生血管性AMD等疾病的一线方案，但是不同的患者却对其表现出不同的反应性。有些患者的脉络膜新生血管在初始治疗后即稳定，而有些患者的脉络膜新生血管却在持续性的每月注药达12次后仍有活动[25]。有研究发现，雷珠单抗和阿柏西普还展现出上限效应，即不能单纯通过增大药物剂量获得更好的视力收益[26]。目前应用的单克隆抗体和融合蛋白类药物均通过结合游离的VEGF阻断下游信号通路的激活，抗VEGF药物注射后眼内仍存在较低浓度的VEGF[27]。本研究结果显示，生理状态下内皮细胞表面存在约14.0%的无配体二聚体，配体可以和亲和力更高的二聚体结合而激活增生迁移信号，从而促进新生血管的生成。这一发现提示在临床治疗中需要转换思路，使用VEGFR2的抑制剂或可为目前的临床治疗提供补充。雷莫芦单抗（IMC-1211B，ramucirumab）是人源性IgG抗体，临床前模型显示这种单克隆抗体与VEGFR2-ECD的亲和力更高，通过阻断受体避免多种VEGF亚型发挥激活作用[28]。目前该药物已经获批用于转移性非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的治疗，已有应用于眼科治疗的早期安全性评估报道[29]。
抗VEGF药物在眼部的应用为众多眼底新生血管性疾病的患者保留了有用视力，但是这类药物仍有需要改善的地方。完善VEGF与VEGFR2结合激活的生物学结构模型，有助于人们深入了解VEGF信号通路，为进一步探索阻断VEGFR2发生二聚体化提供新的理论依据，为最终抑制NV的形成提供新的思路。
