• 武汉大学人民医院眼科中心 430060;
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目的 探讨新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0(XXM2.0)、Channelrhodopsin-PsCatCh2.0(PsCatCh2.0)的光敏感性及动力学特征,分析其是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。方法 通过分子生物学技术将XXM2.0和PsCatCh2.0的基因片段连接到包含抗氨苄青霉素筛选基因和报告基因的载体pCIG(c)-msFoxn3上,形成新质粒pCIG(c)-msFoxn3-XXM2.0、pCIG(c)-msFoxn3-PsCatCh2.0。将构建的新质粒转染到HEK 293T细胞上,用HEKA膜片钳系统行全细胞模式记录对光反应。在2.7×1016、4.7×1015、6.4×1014 photons/(cm2·s)的光强下记录电流大小;在2.7×1016 photons/(cm2·s)光强下刺激XXM2.0、PsCatCh2.0并让其充分恢复,在Clampfit 10.6软件中分析开放和关闭时间常数;在相同光强下,设置2~32 Hz的光脉冲刺激,记录XXM2.0、PsCatCh2.0的响应情况,并在重复光刺激后间隔4000 ms和200 ms来分析电流衰减情况。组间比较均采用独立样本t检验。结果 在XXM2.0、PsCatCh2.0序列两端引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和EcoRⅤ,酶切后通过T4 DNA连接酶成功构建新质粒pCIG(c)-msFoxn3-XXM2.0和pCIG(c)-msFoxn3-PsCatCh2.0,并转染表达在HEK 293T细胞上。XXM2.0和PsCatCh2.0均表现出光强依赖性,光强越大电流越大。在视网膜安全阈值内的光强6.4×1014 photons/(cm2·s)刺激下,XXM2.0和PsCatCh2.0仍产生较大电流,分别为(92.8±142.0)、(13.9±5.6)pA;两者比较,差异无统计学意义(t=1.24、1.24,P=0.28、0.29)。XXM2.0、PsCatCh2.0的开放时间常数分别为(23.9±6.7)、(2.4±0.8)ms,关闭时间常数分别为(5 803.0±568.2)、(219.9±25.6)ms;两者比较,XXM2.0开放时间常数、关闭时间常数均较PsCatCh2.0大,差异均有统计学意义(t=7.10、31.60,P=0.00、0.00)。在响应频率方面,XXM2.0和PsCatCh2.0均能很好地响应32 Hz的高频率脉冲光刺激,并在较长时间(4000 ms)和较短时间(200 ms)间隔的重复光刺激后均保持较小的电流衰减率。结论 XXM2.0和PsCatCh2.0均可在对视网膜安全的光强条件下被激活,并都能以较低的电流衰减来响应高频率(至少32 Hz)的脉冲光刺激,均满足利用光遗传学来恢复视觉功能所需的光敏蛋白特性。

引用本文: 陈飞, 沈吟. 新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和PsCatCh2.0恢复视觉功能的可行性分析. 中华眼底病杂志, 2020, 36(11): 838-845. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200529-00253 复制

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