引用本文： 刘一帆, 沈吟. 低浓度氯喹保护成年小鼠视网膜神经节细胞抵抗N-甲基-D-天冬氨酸的兴奋性毒性作用. 中华眼底病杂志, 2020, 36(4): 295-301. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190903-00275 复制
RGC的丢失与高浓度谷氨酸过度激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体所产生的兴奋性毒性相关[1]。RGC的损伤可导致不可逆性视觉障碍。氯喹是一种主要用于治疗疟疾的药物，由于其抗炎特性，对部分自身免疫性疾病等亦有一定作用[2]。研究表明，不同浓度氯喹在体内和体外具有不同甚至相反作用。脑卒中大鼠模型中，低浓度氯喹可促进神经节苷脂（GM1）在细胞中的积累，减轻血脑屏障的损伤[3-4]。GM1是一种主要的脑GM1，具有神经保护特性[5]。然而，长期使用则会产生视网膜毒性[6-7]。有研究发现，长期服用氯喹的患者和小鼠RGC丧失和视网膜神经纤维层（RNFL）显著变薄[8]。通过对离体大鼠RGC的电生理检测发现，氯喹的毒性可能通过调节酸敏离子通道ASIC 1a而影响视觉传导功能发挥其作用[9]。提示氯喹可能激活不同信号通路从而对视网膜内细胞产生不同作用。本研究观察了不同浓度氯喹对NMDA损伤模型小鼠RGC的影响，初步探索低浓度氯喹对RGC的保护作用及可能调控机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与建模
雄性C57/BL6小鼠54只，4～6周龄，体重15～22 g，武汉大学人民医院动物中心提供（许可证号：SYXK鄂2015-0027）。饲养于标准（12 h明/12 h暗循环）清洁级环境；实验动物操作符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定，并获得武汉大学人民医院实验动物伦理委员会许可[编号：WDRM动（福）第20190113号]。采用随机数字表法将小鼠分为氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组，每组均为18只。根据前期预实验结果，氯喹低浓度组小鼠按体重10 mg/kg剂量腹腔注射2 mg/ml氯喹；氯喹高浓度组小鼠按100 mg/kg剂量腹腔注射20 mg/ml氯喹；PBS对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。3组小鼠1次/d腹腔注射相应药物至动物处死取材。2 d后参照文献[10]的方法，3组小鼠左眼（模型眼）玻璃体腔注射5 nmol/L NMDA（美国Sigma公司）1 μl建模，对侧眼注射等体积PBS。已剔除虹膜出血、晶状体受损、穿刺及拔针过程中漏液过多以及注射后出现眼部感染的小鼠。
1.2 全视网膜铺片及RGC计数
建模后7 d，颈椎脱臼法处死小鼠摘除眼球，每组分别选取6只眼球，去除眼前节后，4%多聚甲醛固定30 min，取出视网膜于5%牛血清白蛋白（武汉Goodbio Technology公司）和0.4% Triton X-100 溶液中4 ℃封闭过夜，4 ℃孵育抗Brn3a抗体（山羊，1:200，美国Santa cruz公司）24 h，PBS漂洗后视网膜置于Alexa Fluor 594标记驴抗山羊IgG二抗（1:500，美国Santa Cruz公司）室温孵育5 h，PBS漂洗后抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜（BX53，日本Olympus公司）下观察并拍照。以视盘为中心，将视网膜分为颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限，每个象限从距视盘1/6、1/2、5/6半径处划分为中央、中间、周边3区（图1），荧光显微镜10×40倍视野下，每个象限的每个分区各随机选取3个视野，按序进行拍照，应用Image J软件进行视网膜铺片RGC计数。每个视野的实际面积为0.097 2 mm2，计算并比较各组小鼠视网膜单位面积RGC数量。
图1
视网膜铺片RGC计数模式图
1.3 HE染色观察不同浓度氯喹对小鼠视网膜整体结构的影响
建模后7 d，每组选取3只眼球，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定24 h。石蜡包埋，沿平行于视神经的矢状轴切片，厚度为5 μm。HE染色，封片后光学显微镜下观察。每只眼球选取1张包含视神经的视网膜切片，应用Image J软件测量距视神经200 μm两侧的内层视网膜（IRL）厚度和视网膜全层厚度。IRL厚度为神经节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）。比较各组小鼠IRL/全层视网膜的比值。
1.4 视动反应（OMR）评估各组小鼠视敏度[11 ]
建模后9 d，参照文献[12]的方法每组选取9只小鼠提前暗适应4 h，应用虚拟光眼视动力仪OptoMotry检测各组小鼠视敏度。小鼠放置于由4个计算机屏幕围绕的平台中心，同时屏幕上显示不同空间频率的移动光栅，小鼠看到光栅时头部会发生运动。通过增加光栅的空间频率量化视敏度阈值，定义视敏度。
1.5 全视野ERG检测各组小鼠内层视网膜功能
建模后10 d，应用RetiMINER视觉电生理仪（重庆艾尔曦医疗设备有限公司）记录ERG的光负性反应（PhNR）波，刺激器为Ganzfeld全视野刺激器。每组选取9只小鼠提前暗适应过夜，记录电极为镀金线圈电极，参考电极和接地电极分别插入两耳之间皮下和尾部，小鼠在25 cd.s/m2的绿光背景中明适应5 min，刺激光为强度10.0 cd.s/m2的绿光，PhNR波为b波后的一个负向波，其振幅为基线到该波谷的距离。
1.6 视网膜免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白（GFAP）荧光表达
建模后11 d，颈椎脱臼法处死小鼠后摘除眼球，每组分别选取3只眼球行视网膜冰冻切片[13]。将视杯视神经矢状切成14 μm厚的切片，GFAP抗体（兔，1∶1000，丹麦DAKO公司）和Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗（1∶500，美国Santa Cruz公司）孵育，DAPI孵育后封片，激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）观察GFAP在视网膜组织上的荧光表达情况，应用Image J软件进行视网膜切片GFAP免疫荧光染色的相对定量。比较各组小鼠视网膜GFAP荧光阳性面积占视网膜总面积的百分比。
1.7 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组小鼠视网膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表达
建模后11 d，每组取6只眼球，应用TRIzol提取视网膜总RNA，逆转录成cDNA，引物由武汉擎科生物公司合成。GFAP：正向引物5’- CCCTGGCTCGTGTGGATTT-3’，反向引物5’- GACCGATACCACTCCTCTGTC-3’；IL-6：正向引物5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’，反向引物5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’；TNF-α：正向引物5’-GCGGAGTCCGGGCAGGTCTA-3’，反向引物5’-GGGGGCTGGCTCTGTGAGGA-3’；GAPDH：正向引物5’-CCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3’，反向引物5’-GGTCTGGGATGGAAATTGTGAGGG-3’。
1.8 统计学方法
采用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（
）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
荧光显微镜观察发现，氯喹低浓度组小鼠视网膜Brn3a红色荧光信号较PBS对照组和氯喹高浓度组明显增多（图2）。建模后7 d，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠模型眼RGC密度分别为（1 555.0±135.95）、（416.7±29.15）、（550.4±94.08）个/mm2。氯喹低浓度组小鼠模型眼RGC密度明显高于PBS对照组、氯喹高浓度组，差异有统计学意义（F=54.41，P＜0.01）；氯喹高浓度组小鼠模型眼RGC密度低于PBS对照组，但差异无统计学意义（F=1.18，P＞0.05）（图3A）。氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠对侧眼RGC密度分别为（2 988.7±168.88）、（3 640.3±91.90）、（3 476.22±165.23）个/mm2；三组小鼠对侧眼RGC密度比较，差异无统计学意义（F=5.19，P＞0.05）（图3B）。
图2
三组小鼠视网膜荧光显微镜像。2A、2B、2C分别示氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组。红色荧光为Brn3a标记的RGC，氯喹低浓度组小鼠视网膜Brn3a红色荧光信号较PBS对照组和氯喹高浓度组均明显增多 Brn3a 标尺：50 μm
图3
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠模型眼、对侧眼RGC密度比较。3A、3B分别示模型眼、对侧眼。n=3，**P＜0.01
光学显微镜观察发现，各组小鼠视网膜组织GCL、内核层（INL）和外核层（ONL）仍可分辨；GCL细胞核固缩、排列较紊乱。与PBS对照组比较，氯喹低浓度组小鼠视网膜IPL厚度变厚；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜IPL厚度无明显增厚（图4）。氯喹低浓度组小鼠IRL与全层视网膜厚度比值高于氯喹高浓度组、PBS对照组，差异有统计学意义（F=10.36，P＜0.01）；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠IRL与全层视网膜厚度比值比较，差异无统计学意义（F=0.02，P＞0.05）（图5）。
图4
三组小鼠视网膜光学显微镜像。4A、4B、4C分别示氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组。各组小鼠视网膜组织GCL、INL、ONL仍可分辨；GCL细胞核固缩、排列较紊乱。氯喹低浓度组小鼠视网膜IPL厚度较PBS对照组增厚，氯喹高浓度组IPL厚度与PBS对照组无明显增厚 HE ×400
图5
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠IRL与全层视网膜比值比较。n=3，**P＜0.01
建模后11 d，全视野ERG检查结果显示，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅分别为（19.6±1.36）、（11.8±0.81）、（12.0±0.92）μV。氯喹低浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅比较，差异有统计学意义（F=17.60，P＜0.01）；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅为比较，差异无统计学意义（F=0.10，P＞0.05）（图6）。
图6
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅比较。6A示小鼠典型PhNR波形；6B示各组小鼠PhNR波振幅比较。n=9，**P＜0.01，****P＜0.000 1
OMR检测结果显示，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视敏度分别为（0.16±0.04）、（0.01±0.01）、（0.05±0.03）dB。与PBS对照组小鼠视敏度比较，氯喹低浓度组差异有统计学意义（F=9.10，P＜0.05），氯喹高浓度组差异无统计学意义（F=1.80，P＞0.05）（图7）。
图7
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视敏度比较。n=9，*P＜0.05
激光共聚焦显微镜观察发现，PBS对照组、氯喹高浓度组小鼠视网膜GCL和RNFL可见大量GFAP绿色荧光表达；氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组（图8，9）。
图8
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜激光共聚焦显微镜像。8A、8B、8C分别示PBS对照组、氯喹低浓度组、氯喹高浓度组。PBS对照组、高浓度氯喹组小鼠视网膜GCL和RNFL可见大量GFAP绿色荧光表达；氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组 标尺：20 μm
图9
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达比较。n=3，**P＜0.01，*P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，低浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组显著下降，差异有统计学意义（F=110.20，P＜0.01）；高浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP mRNA表达显著高于PBS对照组，差异有统计学意义（F=129.29，P＜0.000 1）。氯喹低浓度组小鼠视网膜IL-6、TNF-α mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组下降，差异有统计学意义（F=167.60、17.78，P＜0.001、＜0.01）；氯喹高浓度组小鼠视网膜IL-6、TNF-α mRNA表达较PBS对照组显著升高，差异有统计学意义（F=212.44，P＜0.000 1；F=8.524，P＜0.05）（图10）。
图10
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜TNF-α、GFAP、IL-6 mRNA表达比较。10A示TNF-α；10B示GFAP；10C示IL-6。n=6，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1
3 讨论
氯喹作为一种抗疟药物[2]，目前也被用作抗逆转录病毒剂治疗艾滋病和放射治疗增敏剂治疗恶性肿瘤[14]。氯喹类药物的眼部毒性是其毒性的一个重要方面，氯喹与黑色素细胞的较强亲和力可导致细胞不可逆转损害，然而，目前氯喹如何引起视网膜毒性尚未完全确定。研究表明，氯喹的眼部毒性作用与剂量和持续时间有关，尤其是在长期服用的患者中更多见[15]。早期阶段，视网膜病变无症状且进展缓慢；晚期阶段，氯喹所致视网膜神经感觉层变薄，RGC严重丧失[16-17]，最终导致中心视力不可逆丧失。
近年有研究发现低浓度氯喹具有神经保护作用。在体内，低浓度氯喹可促进具有神经保护特性的GM1在脑卒中大鼠的神经细胞中积累[5]，减轻血脑屏障损伤[3-4]；在体外，低浓度氯喹可保护海马HT22细胞免受谷氨酸的兴奋性毒性作用[18]。在药理学方面，低于1 mol/L浓度的氯喹可使GM1在PC12细胞表面堆积[3]。因此，低浓度氯喹可致GM1上调发挥其神经保护作用。
玻璃体腔注射NMDA可导致RGC死亡，已被应用于诱导多种动物视网膜的兴奋性毒性[19-21]。本研究结果显示，低浓度氯喹（10 mg/kg）可以在组织形态学、视觉电生理功能和行为学方面保护RGC，减少其因NMDA的兴奋性毒性作用导致的死亡；高浓度氯喹（100 mg/kg）对RGC无保护作用，反而可能会加重RGC的损伤。
有研究表明，胶质活化和炎性反应在青光眼病理机制中起重要作用[22]，GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，在视网膜中主要标记Müller细胞。Müller细胞的活化是视网膜内细胞损伤和死亡的最敏感和非特异性指标，在视网膜疾病的炎症反应中起重要作用[23-26]，可促进促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α的产生。氯喹由于其抗炎特性被广泛运用于类风湿炎症的治疗。有文献报道，氯喹可通过抑制炎症保护角膜上皮细胞[27]。本研究结果显示，在NMDA损伤后，经低浓度氯喹治疗的小鼠视网膜GFAP的荧光表达及mRNA含量较PBS对照组（未处理）明显减少，与低浓度氯喹组RGC密度更高一致；而氯喹高浓度组则不同，提示胶质细胞活化可能促进视网膜的修复。结果表明低浓度氯喹可能通过抑制胶质活化和炎症反应，而在NMDA损伤中发挥对RGC的神经保护作用。
本研究采用RGC的特异标记抗体Brn3a进行视网膜铺片免疫荧光染色，以评估RGC的存活数量[28]。结果显示，低浓度氯喹能增加NMDA损伤后RGC的存活。为确定存活的RGC是否对光有反应，我们同时测试了小鼠ERG PhNR波以评估RGC的生物电活动。青光眼患者和部分啮齿动物的青光眼模型中，由于RGC的损伤可导致PhNR波振幅降低。因此，PhNR波振幅被认为是RGC的对光生物电活动，同时也代表视网膜内层的无长突细胞和胶质细胞的电活动[29-31]。本研究结果显示，NMDA损伤后，氯喹低浓度组小鼠PhNR波振幅提高到正常小鼠的80%以上，表明低浓度氯喹对RGC的保护不仅体现在形态上，还能保存RGC的电生理功能。
OMR由于其不需要传统视觉行为测试的增强训练，已广泛应用于视网膜退行性疾病小鼠的视觉功能测试[32]。本研究结果表明，氯喹低浓度组小鼠视敏度明显优于PBS对照组，进一步提示低浓度氯喹对RGC的神经保护作用。
本研究证实低浓度氯喹（10 mg/kg）对NMDA损伤所致RGC丢失的保护作用，其作用机制可能与抑制胶质细胞活化与炎症反应有关；高浓度氯喹（100 mg/kg）对RGC有潜在毒性作用，故适当剂量的氯喹可能是治疗视网膜兴奋性毒性的有效方法。在今后进一步研究中，拟进一步在分子和蛋白水平定量低浓度氯喹对NMDA所致损伤炎症反应的抑制程度并探索其中具体的分子机制与信号通路。
RGC的丢失与高浓度谷氨酸过度激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体所产生的兴奋性毒性相关[1]。RGC的损伤可导致不可逆性视觉障碍。氯喹是一种主要用于治疗疟疾的药物，由于其抗炎特性，对部分自身免疫性疾病等亦有一定作用[2]。研究表明，不同浓度氯喹在体内和体外具有不同甚至相反作用。脑卒中大鼠模型中，低浓度氯喹可促进神经节苷脂（GM1）在细胞中的积累，减轻血脑屏障的损伤[3-4]。GM1是一种主要的脑GM1，具有神经保护特性[5]。然而，长期使用则会产生视网膜毒性[6-7]。有研究发现，长期服用氯喹的患者和小鼠RGC丧失和视网膜神经纤维层（RNFL）显著变薄[8]。通过对离体大鼠RGC的电生理检测发现，氯喹的毒性可能通过调节酸敏离子通道ASIC 1a而影响视觉传导功能发挥其作用[9]。提示氯喹可能激活不同信号通路从而对视网膜内细胞产生不同作用。本研究观察了不同浓度氯喹对NMDA损伤模型小鼠RGC的影响，初步探索低浓度氯喹对RGC的保护作用及可能调控机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组与建模
雄性C57/BL6小鼠54只，4～6周龄，体重15～22 g，武汉大学人民医院动物中心提供（许可证号：SYXK鄂2015-0027）。饲养于标准（12 h明/12 h暗循环）清洁级环境；实验动物操作符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定，并获得武汉大学人民医院实验动物伦理委员会许可[编号：WDRM动（福）第20190113号]。采用随机数字表法将小鼠分为氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组，每组均为18只。根据前期预实验结果，氯喹低浓度组小鼠按体重10 mg/kg剂量腹腔注射2 mg/ml氯喹；氯喹高浓度组小鼠按100 mg/kg剂量腹腔注射20 mg/ml氯喹；PBS对照组小鼠腹腔注射等体积PBS。3组小鼠1次/d腹腔注射相应药物至动物处死取材。2 d后参照文献[10]的方法，3组小鼠左眼（模型眼）玻璃体腔注射5 nmol/L NMDA（美国Sigma公司）1 μl建模，对侧眼注射等体积PBS。已剔除虹膜出血、晶状体受损、穿刺及拔针过程中漏液过多以及注射后出现眼部感染的小鼠。
1.2 全视网膜铺片及RGC计数
建模后7 d，颈椎脱臼法处死小鼠摘除眼球，每组分别选取6只眼球，去除眼前节后，4%多聚甲醛固定30 min，取出视网膜于5%牛血清白蛋白（武汉Goodbio Technology公司）和0.4% Triton X-100 溶液中4 ℃封闭过夜，4 ℃孵育抗Brn3a抗体（山羊，1:200，美国Santa cruz公司）24 h，PBS漂洗后视网膜置于Alexa Fluor 594标记驴抗山羊IgG二抗（1:500，美国Santa Cruz公司）室温孵育5 h，PBS漂洗后抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜（BX53，日本Olympus公司）下观察并拍照。以视盘为中心，将视网膜分为颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限，每个象限从距视盘1/6、1/2、5/6半径处划分为中央、中间、周边3区（图1），荧光显微镜10×40倍视野下，每个象限的每个分区各随机选取3个视野，按序进行拍照，应用Image J软件进行视网膜铺片RGC计数。每个视野的实际面积为0.097 2 mm2，计算并比较各组小鼠视网膜单位面积RGC数量。
图1
视网膜铺片RGC计数模式图
1.3 HE染色观察不同浓度氯喹对小鼠视网膜整体结构的影响
建模后7 d，每组选取3只眼球，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定24 h。石蜡包埋，沿平行于视神经的矢状轴切片，厚度为5 μm。HE染色，封片后光学显微镜下观察。每只眼球选取1张包含视神经的视网膜切片，应用Image J软件测量距视神经200 μm两侧的内层视网膜（IRL）厚度和视网膜全层厚度。IRL厚度为神经节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）。比较各组小鼠IRL/全层视网膜的比值。
1.4 视动反应（OMR）评估各组小鼠视敏度[11 ]
建模后9 d，参照文献[12]的方法每组选取9只小鼠提前暗适应4 h，应用虚拟光眼视动力仪OptoMotry检测各组小鼠视敏度。小鼠放置于由4个计算机屏幕围绕的平台中心，同时屏幕上显示不同空间频率的移动光栅，小鼠看到光栅时头部会发生运动。通过增加光栅的空间频率量化视敏度阈值，定义视敏度。
1.5 全视野ERG检测各组小鼠内层视网膜功能
建模后10 d，应用RetiMINER视觉电生理仪（重庆艾尔曦医疗设备有限公司）记录ERG的光负性反应（PhNR）波，刺激器为Ganzfeld全视野刺激器。每组选取9只小鼠提前暗适应过夜，记录电极为镀金线圈电极，参考电极和接地电极分别插入两耳之间皮下和尾部，小鼠在25 cd.s/m2的绿光背景中明适应5 min，刺激光为强度10.0 cd.s/m2的绿光，PhNR波为b波后的一个负向波，其振幅为基线到该波谷的距离。
1.6 视网膜免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白（GFAP）荧光表达
建模后11 d，颈椎脱臼法处死小鼠后摘除眼球，每组分别选取3只眼球行视网膜冰冻切片[13]。将视杯视神经矢状切成14 μm厚的切片，GFAP抗体（兔，1∶1000，丹麦DAKO公司）和Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗（1∶500，美国Santa Cruz公司）孵育，DAPI孵育后封片，激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）观察GFAP在视网膜组织上的荧光表达情况，应用Image J软件进行视网膜切片GFAP免疫荧光染色的相对定量。比较各组小鼠视网膜GFAP荧光阳性面积占视网膜总面积的百分比。
1.7 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组小鼠视网膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表达
建模后11 d，每组取6只眼球，应用TRIzol提取视网膜总RNA，逆转录成cDNA，引物由武汉擎科生物公司合成。GFAP：正向引物5’- CCCTGGCTCGTGTGGATTT-3’，反向引物5’- GACCGATACCACTCCTCTGTC-3’；IL-6：正向引物5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’，反向引物5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’；TNF-α：正向引物5’-GCGGAGTCCGGGCAGGTCTA-3’，反向引物5’-GGGGGCTGGCTCTGTGAGGA-3’；GAPDH：正向引物5’-CCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3’，反向引物5’-GGTCTGGGATGGAAATTGTGAGGG-3’。
1.8 统计学方法
采用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
荧光显微镜观察发现，氯喹低浓度组小鼠视网膜Brn3a红色荧光信号较PBS对照组和氯喹高浓度组明显增多（图2）。建模后7 d，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠模型眼RGC密度分别为（1 555.0±135.95）、（416.7±29.15）、（550.4±94.08）个/mm2。氯喹低浓度组小鼠模型眼RGC密度明显高于PBS对照组、氯喹高浓度组，差异有统计学意义（F=54.41，P＜0.01）；氯喹高浓度组小鼠模型眼RGC密度低于PBS对照组，但差异无统计学意义（F=1.18，P＞0.05）（图3A）。氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠对侧眼RGC密度分别为（2 988.7±168.88）、（3 640.3±91.90）、（3 476.22±165.23）个/mm2；三组小鼠对侧眼RGC密度比较，差异无统计学意义（F=5.19，P＞0.05）（图3B）。
图2
三组小鼠视网膜荧光显微镜像。2A、2B、2C分别示氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组。红色荧光为Brn3a标记的RGC，氯喹低浓度组小鼠视网膜Brn3a红色荧光信号较PBS对照组和氯喹高浓度组均明显增多 Brn3a 标尺：50 μm
图3
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠模型眼、对侧眼RGC密度比较。3A、3B分别示模型眼、对侧眼。n=3，**P＜0.01
光学显微镜观察发现，各组小鼠视网膜组织GCL、内核层（INL）和外核层（ONL）仍可分辨；GCL细胞核固缩、排列较紊乱。与PBS对照组比较，氯喹低浓度组小鼠视网膜IPL厚度变厚；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜IPL厚度无明显增厚（图4）。氯喹低浓度组小鼠IRL与全层视网膜厚度比值高于氯喹高浓度组、PBS对照组，差异有统计学意义（F=10.36，P＜0.01）；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠IRL与全层视网膜厚度比值比较，差异无统计学意义（F=0.02，P＞0.05）（图5）。
图4
三组小鼠视网膜光学显微镜像。4A、4B、4C分别示氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组。各组小鼠视网膜组织GCL、INL、ONL仍可分辨；GCL细胞核固缩、排列较紊乱。氯喹低浓度组小鼠视网膜IPL厚度较PBS对照组增厚，氯喹高浓度组IPL厚度与PBS对照组无明显增厚 HE ×400
图5
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠IRL与全层视网膜比值比较。n=3，**P＜0.01
建模后11 d，全视野ERG检查结果显示，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅分别为（19.6±1.36）、（11.8±0.81）、（12.0±0.92）μV。氯喹低浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅比较，差异有统计学意义（F=17.60，P＜0.01）；氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅为比较，差异无统计学意义（F=0.10，P＞0.05）（图6）。
图6
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠PhNR波振幅比较。6A示小鼠典型PhNR波形；6B示各组小鼠PhNR波振幅比较。n=9，**P＜0.01，****P＜0.000 1
OMR检测结果显示，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视敏度分别为（0.16±0.04）、（0.01±0.01）、（0.05±0.03）dB。与PBS对照组小鼠视敏度比较，氯喹低浓度组差异有统计学意义（F=9.10，P＜0.05），氯喹高浓度组差异无统计学意义（F=1.80，P＞0.05）（图7）。
图7
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视敏度比较。n=9，*P＜0.05
激光共聚焦显微镜观察发现，PBS对照组、氯喹高浓度组小鼠视网膜GCL和RNFL可见大量GFAP绿色荧光表达；氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组（图8，9）。
图8
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜激光共聚焦显微镜像。8A、8B、8C分别示PBS对照组、氯喹低浓度组、氯喹高浓度组。PBS对照组、高浓度氯喹组小鼠视网膜GCL和RNFL可见大量GFAP绿色荧光表达；氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组 标尺：20 μm
图9
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达比较。n=3，**P＜0.01，*P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，低浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组显著下降，差异有统计学意义（F=110.20，P＜0.01）；高浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP mRNA表达显著高于PBS对照组，差异有统计学意义（F=129.29，P＜0.000 1）。氯喹低浓度组小鼠视网膜IL-6、TNF-α mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组下降，差异有统计学意义（F=167.60、17.78，P＜0.001、＜0.01）；氯喹高浓度组小鼠视网膜IL-6、TNF-α mRNA表达较PBS对照组显著升高，差异有统计学意义（F=212.44，P＜0.000 1；F=8.524，P＜0.05）（图10）。
图10
氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组小鼠视网膜TNF-α、GFAP、IL-6 mRNA表达比较。10A示TNF-α；10B示GFAP；10C示IL-6。n=6，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1
3 讨论
氯喹作为一种抗疟药物[2]，目前也被用作抗逆转录病毒剂治疗艾滋病和放射治疗增敏剂治疗恶性肿瘤[14]。氯喹类药物的眼部毒性是其毒性的一个重要方面，氯喹与黑色素细胞的较强亲和力可导致细胞不可逆转损害，然而，目前氯喹如何引起视网膜毒性尚未完全确定。研究表明，氯喹的眼部毒性作用与剂量和持续时间有关，尤其是在长期服用的患者中更多见[15]。早期阶段，视网膜病变无症状且进展缓慢；晚期阶段，氯喹所致视网膜神经感觉层变薄，RGC严重丧失[16-17]，最终导致中心视力不可逆丧失。
近年有研究发现低浓度氯喹具有神经保护作用。在体内，低浓度氯喹可促进具有神经保护特性的GM1在脑卒中大鼠的神经细胞中积累[5]，减轻血脑屏障损伤[3-4]；在体外，低浓度氯喹可保护海马HT22细胞免受谷氨酸的兴奋性毒性作用[18]。在药理学方面，低于1 mol/L浓度的氯喹可使GM1在PC12细胞表面堆积[3]。因此，低浓度氯喹可致GM1上调发挥其神经保护作用。
玻璃体腔注射NMDA可导致RGC死亡，已被应用于诱导多种动物视网膜的兴奋性毒性[19-21]。本研究结果显示，低浓度氯喹（10 mg/kg）可以在组织形态学、视觉电生理功能和行为学方面保护RGC，减少其因NMDA的兴奋性毒性作用导致的死亡；高浓度氯喹（100 mg/kg）对RGC无保护作用，反而可能会加重RGC的损伤。
有研究表明，胶质活化和炎性反应在青光眼病理机制中起重要作用[22]，GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，在视网膜中主要标记Müller细胞。Müller细胞的活化是视网膜内细胞损伤和死亡的最敏感和非特异性指标，在视网膜疾病的炎症反应中起重要作用[23-26]，可促进促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α的产生。氯喹由于其抗炎特性被广泛运用于类风湿炎症的治疗。有文献报道，氯喹可通过抑制炎症保护角膜上皮细胞[27]。本研究结果显示，在NMDA损伤后，经低浓度氯喹治疗的小鼠视网膜GFAP的荧光表达及mRNA含量较PBS对照组（未处理）明显减少，与低浓度氯喹组RGC密度更高一致；而氯喹高浓度组则不同，提示胶质细胞活化可能促进视网膜的修复。结果表明低浓度氯喹可能通过抑制胶质活化和炎症反应，而在NMDA损伤中发挥对RGC的神经保护作用。
本研究采用RGC的特异标记抗体Brn3a进行视网膜铺片免疫荧光染色，以评估RGC的存活数量[28]。结果显示，低浓度氯喹能增加NMDA损伤后RGC的存活。为确定存活的RGC是否对光有反应，我们同时测试了小鼠ERG PhNR波以评估RGC的生物电活动。青光眼患者和部分啮齿动物的青光眼模型中，由于RGC的损伤可导致PhNR波振幅降低。因此，PhNR波振幅被认为是RGC的对光生物电活动，同时也代表视网膜内层的无长突细胞和胶质细胞的电活动[29-31]。本研究结果显示，NMDA损伤后，氯喹低浓度组小鼠PhNR波振幅提高到正常小鼠的80%以上，表明低浓度氯喹对RGC的保护不仅体现在形态上，还能保存RGC的电生理功能。
OMR由于其不需要传统视觉行为测试的增强训练，已广泛应用于视网膜退行性疾病小鼠的视觉功能测试[32]。本研究结果表明，氯喹低浓度组小鼠视敏度明显优于PBS对照组，进一步提示低浓度氯喹对RGC的神经保护作用。
本研究证实低浓度氯喹（10 mg/kg）对NMDA损伤所致RGC丢失的保护作用，其作用机制可能与抑制胶质细胞活化与炎症反应有关；高浓度氯喹（100 mg/kg）对RGC有潜在毒性作用，故适当剂量的氯喹可能是治疗视网膜兴奋性毒性的有效方法。在今后进一步研究中，拟进一步在分子和蛋白水平定量低浓度氯喹对NMDA所致损伤炎症反应的抑制程度并探索其中具体的分子机制与信号通路。
